技术特征：
1.一种用于检测抑制肝癌血管生成中的etv4表达量的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括用于检测etv4表达量的qpcr试剂以及检测抑制肝癌血管生成的cd31抗体。2.根据权利要求1所述的一种用于检测抑制肝癌血管生成中的etv4表达量的试剂盒，其特征在于，所述qpcr试剂是etv4基因表达的引物(5
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ccctgagaaatttgaaggagac-3’，5
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gtccaggcaatgaaatgggca-3’)，即rna提取及逆转录试剂，抑制etv4表达量的shrna序列(5
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gctccgatactattatgagaa-3’)。3.根据权利要求2所述的一种用于检测抑制肝癌血管生成中的etv4表达量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在实验中的应用包括：(1)、采用慢病毒转染细胞的实验方法抑制etv4表达；(2)、体内实验检测抑制etv4表达后对肿瘤微环境血管生成能力的影响；(3)、体外实验检测抑制etv4表达后对肿瘤微环境血管生成能力的影响。4.根据权利要求3所述的一种用于检测抑制肝癌血管生成中的etv4表达量的试剂盒，其特征在于，所述抑制etv4表达在实验中的应用中(1)的实验步骤包括：s1：取处于对数生长期的细胞接种到6孔板培养板里，细胞密度为5
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104个/ml，37℃培养16-24h，至细胞汇合度为20-30％；s2：根据病毒滴度，向6孔板的培养基中分别加入对应量的含敲低基因序列及相应对照序列的慢病毒载体，并加入相应的感染增强液，混匀后于30-40℃培养箱静置培养；s3：培养12-16h后更换为完全培养基，继续培养；s4：慢病毒感染后30-50h，更换为含有嘌呤霉素(根据实验细胞选择对应的浓度)的完全培养基筛选稳定细胞株，之后细胞每2d更换一次培养基，持续10-20d；s5：稳定转染10-20d后，提取稳定转染细胞株的总rna，检测目的基因的表达水平，etv4shrna使肝癌细胞系mhcc-97h中etv4表达的表达水平下降至20％，etv4shrna具有明显的抑制效果。5.根据权利要求3所述的一种用于检测抑制肝癌血管生成中的etv4表达量的试剂盒，其特征在于，所述抑制etv4表达在实验中的应用中(2)的实验步骤包括：s1：选取2w龄的balb/c-nu实验品，在spf级动物房中继续饲养4w；s2：将6w龄的实验品分为2组，经实验品静脉分别注射稳定转染的97h-shnc和97h-shetv4细胞；s3：30d后，使用实验品成像仪获取静脉注射后的肝转移瘤和肺转移瘤的荧光图像；s4：取出实验品内的转移性成瘤组织，制作石蜡切片，并进行免疫组化，检测内皮细胞标记cd31表达，与对照组相比，etv4表达下降至20％后，血管内皮细胞阳性标志分子cd31明显减少，肿瘤组织内形成的微血管数目和密度明显降低，说明敲低etv4的表达对肿瘤微环境血管生成能力的影响。6.根据权利要求3所述的一种用于检测抑制肝癌血管生成中的etv4表达量的试剂盒，其特征在于，所述抑制etv4表达在实验中的应用中(3)的实验步骤包括：s1：将稳定转染的shetv4细胞及其对应的shnc细胞培养至50％-60％汇合度后，更换新鲜的完全培养基并培养48h；s2：收集上清培养基，800-1500rpm离心5-15min，上清液经过0.22μm过滤器过滤，获得条件培养基；
s3：将huvec细胞在条件培养基中培养12h；s4：向预冷的96孔板中加入基质胶cd31抗体，50μl/孔，确保均匀，于37℃培养箱中放置待凝固；s5：将共培养后的huvec细胞以1-2
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105个/ml浓度重新悬浮在对应的条件培养基中，取100μl铺在基质胶cd31抗体表面，于37℃培养箱中培养；s6：12h内观察huvec成管形态、成管数量及密度，用imagej软件分析，统计细胞的成管长度、分支数及节点等数据，与对照组细胞(97h-shnc)相比，敲低etv4表达的hcc细胞(97h-shetv4)与血管内皮细胞(huvec)细胞共培养检测血管形成实验，etv4表达下降至20％后，内皮细胞的血管成管长度和数量显著降低。
技术总结
一种用于检测抑制肝癌血管生成中的ETV4表达量的试剂盒，试剂盒包括用于检测ETV4表达量的qPCR试剂以及检测抑制肝癌血管生成的CD31抗体。试剂盒通过用于敲低ETV4表达的shRNA能够有效地降低HCC细胞中ETV4的表达水平，而ETV4的表达水平下降后，明显降低了肝癌组织中新生血管的生成，在HCC抗血管治疗中敲低ETV4的表达起到辅助疗效的作用，ETV4基因在肝癌组织中呈现高表达，且抑制ETV4基因表达能明显抑制HCC的血管生成。HCC为富于血管的实体瘤,血管生成对肿瘤的生长、侵袭和转移都有决定性的作用。因此，在HCC治疗中，抑制ETV4减弱HCC的血管生成，达到辅助治疗中晚期HCC的作用。用。用。
技术研发人员：樊红 苏宏萌 郑楚骞 李懿萍
受保护的技术使用者：东南大学
技术研发日：2022.08.24
技术公布日：2023/1/31