一种无紫外光琼脂糖凝胶中DNA提取方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种无紫外光琼脂糖凝胶中dna提取方法。

背景技术：

1、从琼脂糖凝胶中提取dna是进行分子克隆、转基因等分子生物学实验的基础。琼脂糖是由β-d-半乳糖和3,6-内醚-l-半乳糖交替连接起来的直链多糖，因其具有亲水性，几乎不含有带电基团，对生物大分子很少引起变性和吸附，是生物技术领域最理想的惰性支持介质。琼脂糖凝胶是将琼脂糖溶于水中加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成半固体状的凝胶，琼脂糖凝胶依靠糖链之间的次级键如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖凝胶的浓度。一般情况，它的结构稳定，可以在广泛的条件下使用。琼脂糖凝胶电泳是在外加电场作用下，带负电荷的dna片段根据构象和分子量大小不同在琼脂糖凝胶上的电泳速度不同达到分离。

2、现有的琼脂糖凝胶电泳提取dna方法存在许多不足，提取过程中会加入荧光染料如溴化乙锭、sybrgreen等，然后电泳结束后在紫外光下进行切胶操作，荧光染料具有强毒性、强致突变性、难降解等特点，实验人员需要较长时间的接触紫外光和荧光染料，对实验者和环境造成较大的危害；而且整个切胶操作需要在紫外光下操作，易造成样品dna的损伤，导致基因突变，给后续实验结果带来不确定性。

3、专利cn102690880a公开了一种基于琼脂糖凝胶的电泳方法，首先制备琼脂糖溶液并在电泳槽中凝固成一定形状的胶状物，然后向琼脂糖凝胶的不同区域加入需要分离的物质并插上电源进行电泳，最后通过溴化乙锭的染色，在紫外灯下可以观察到凝胶上dna的分离，该专利中电泳结束后在琼脂糖凝胶中加入溴化乙锭使其与电泳分离的dna进行染色，然后在紫外灯下切胶提取目的dna条带，该方法需要的样品量少，分辨能力高，设备简单，但是过程中加入溴化乙锭进行染色dna，溴化乙锭具有一定的毒性，可致癌，对环境和人体都有很大的损害，实验结束后需要对含溴化乙锭的溶液进行净化处理再行弃置，而且使用溴化乙锭染色dna后需要在紫外灯光的照射下才能产生颜色信号，紫外光的照射容易造成dna的损伤，导致基因突变，导致实验结果达不到预期。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种无紫外光琼脂糖凝胶中dna提取方法。

2、实现本发明目的的技术方案是：一种无紫外光琼脂糖凝胶中dna提取方法，包括以下步骤：

3、s1：琼脂糖凝胶的制备：将琼脂糖粉末加入tae缓冲液中，90-180℃加热3-60min使其融化，室温下冷却5-10min，接着加入非荧光染色液混匀，然后将其倒入事先准备好的胶板内进行凝固；

4、s2：dna分离：在dna样品中加入6x上样缓冲液，将其一次加入琼脂糖凝胶的点样孔内，110v电压下电泳20-60min至不同dna的条带在琼脂糖凝胶中完全分离；

5、s3：dna提取：从电泳槽中取出琼脂糖凝胶，使用干净的刀片沿目的dna的条带附近切下琼脂糖凝胶，称重后将其放置到干净的离心管中,并加入1-3倍琼脂糖凝胶体积的溶胶液于50-120℃下加热融化，接着加入磁珠溶液和结合液进行dna提取；

6、s4：dna的洗涤、洗脱；

7、其中，所述tae缓冲液是由三羟甲基氨基甲烷(tris base)、冰乙酸(acetic acid)和乙二胺四乙酸(edta)组成的缓冲液，ph为8.0-8.3,每100mg琼脂糖凝胶约相当于100μl；

8、所述非荧光染色液为结晶紫溶液、甲基绿、二苯胺中的一种或多种。

9、本发明的一个方面，所述s1中，琼脂糖粉末在tae缓冲液的分散浓度为0.8%-3%，琼脂糖粉末与非荧光染色液的质量比为(10-200):1；优选地，琼脂糖粉末在tae缓冲液的分散浓度为1%，琼脂糖粉末与非荧光染色液的质量比为50:1。

10、本发明的一个方面，所述非荧光染色液的浓度为1-5mg/ml。

11、本发明的一个方面，所述s2中，dna在上样缓冲液中的分散浓度为200-1000ng/μl；优选地，dna在上样缓冲液中的分散浓度为500ng/μl。

12、本发明的一个方面，所述上样缓冲液为10%-50%甘油、10-50mm edta和1-5mg/ml非荧光染色液,在琼脂糖凝胶的制备过程和dna分离中均添加非荧光染色液，便于实验后期dna的提取。

13、本发明的一个方面，所述s1中，琼脂糖粉末加热融化的方式包括微波加热、水浴加热和油浴加热中的一种；优选地，琼脂糖粉末加热融化的方式采用微波加热。

14、本发明的一个方面，所述s3中，向离心管中依次加入50-200μl磁珠溶液和100-200μl结合液，混匀，室温静置5-30min，然后将离心管置于磁力架上，磁吸1-10min，吸弃上清液。

15、本发明的一个方面，所述s4中，dna的洗涤和洗脱包括在s3所得的产物中加入500-800μl洗涤液，混匀后室温下静置5-10min，然后将离心管置于磁力架上磁吸1-10min，吸弃上清液，最后向离心管中加入30-100μl洗脱液，混匀后室温下静置3-30min，再将离心管置于磁力架上磁吸1-10min，取上清液并转移到干净的离心管中，即回收得到dna；优选地，所述洗涤液的用量为500μl，洗脱液的用量为50μl。

16、本发明的一个方面，所述洗涤液为100-400mm氯化钠、50-75%乙醇，洗脱液为5-10mmtris、1-5mm edta。

17、本发明的一个方面，所述s3中，溶胶液为5-7m碘化钠和5-20mm硫酸钠，磁珠溶液的浓度为10-50mg/ml，结合液为2-8m盐酸胍；优选地，磁珠溶液的浓度为10mg/ml。

18、采用上述技术方案后，本发明具有以下积极的效果：

19、（1）本发明在琼脂糖凝胶中加入非荧光染色液，在外加电场的作用下，带负电荷的dna片段根据构象和分子量大小不同在琼脂糖凝胶上电泳速度不同从而达到分离，非荧光染色液与dna结合产生染色，其中，非荧光染色液结晶紫是一种碱性染料，可以与dna结合，将其染成深紫色；dna在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖之间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖,与非荧光染色液二苯胺反应生成蓝色物质；非荧光染色液甲基绿与dna有特异性亲和力，结合后使dna呈现绿色。因此本发明中的非荧光染色液与dna结合染色后无需紫外灯照射，在白光下即可产生颜色信号，使用刀片可直接将染色后的含有目的dna条带的琼脂糖凝胶切下，接着添加溶胶液，溶解含有目的dna条带的琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶的存在是由于氢键所致，溶胶液能破坏氢键导致琼脂糖凝胶由固态融化成液态，并且溶解后不会复凝，融化后的琼脂糖凝胶中加入磁珠溶液和结合液，目的dna与纳米磁珠结合，然后通过洗涤、洗脱提取得到目的dna。

20、（2）本发明使用非荧光染色液染色dna，在可见光照射的条件下切胶提取琼脂糖凝胶中的目的dna，无需购买昂贵的凝胶成像仪器，过程中无需添加有毒致癌的荧光染料，对实验人员和环境不会造成危害，更重要的是切胶操作无需紫外光照射，避免了紫外光激发对dna样品造成的诱变和损伤，进而影响后续实验结果准确性，而且本发明还具有操作简便、高dna回收率、高产物纯度等优点。