一种识别APF的T细胞受体及其编码序列和应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种识别apf的t细胞受体及其编码序列和应用；尤其涉及能够识别源自afp抗原短肽的tcr及其编码序列，本发明还涉及转导上述tcr来获得的afp特异性的t细胞，及其在预防和治疗afp相关疾病中的用途。

背景技术：

1、afp(αfetoprotein)也称α胎蛋白，是胚胎发育过程中表达的一种蛋白，是胚胎血清的主要成分。在发育过程中，afp在卵黄囊及肝脏中有比较高的表达水平，随后被抑制。在肝细胞癌中，afp的表达被激活(butterfield et al.j immunol.,2001,apr 15；166(8):5300-8)。afp在细胞内生成后被降解成小分子多肽，并与mhc(主组织相容性复合体)分子结合形成复合物，被呈递到细胞表面。tsselmaitr(seq id no:9)是衍生自afp抗原的短肽，是afp相关疾病治疗的一种靶标。

2、t细胞过继免疫治疗是将对靶细胞抗原具有特异性的反应性t细胞转入病人体内，使其针对靶细胞发挥作用。t细胞受体(tcr)是t细胞表面的一种膜蛋白，其能够识别相应的靶细胞表面的抗原短肽。在免疫系统中，通过抗原短肽特异性的tcr与短肽-主组织相容性复合体(pmhc复合物)的结合引发t细胞与抗原呈递细胞(apc)直接的物理接触，然后t细胞及apc两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，引起一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的t细胞对其靶细胞发挥免疫效应。

3、因此，本领域技术人员致力于分离出对afp抗原短肽具有特异性的tcr，以及将该tcr转导t细胞来获得对afp抗原短肽具有特异性的t细胞，从而使他们在细胞免疫治疗中发挥作用。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种识别afp抗原短肽的t细胞受体。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供了一种t细胞受体(tcr)，所述t细胞受体能够与tsselmaitr-hla a1101复合物结合。

4、在另一优选例中，所述tcrα链可变域的3个互补决定区(cdr)为：

5、αcdr1-nsasqs                (seq id no:10)

6、αcdr2-vyssgn                (seq id no:11)

7、αcdr3-vvnpgsgntgkli         (seq id no:12)；和/或

8、所述tcrβ链可变域的3个互补决定区为：

9、βcdr1-sghta                 (seq id no:13)

10、βcdr2-fqgnsa                (seq id no:14)

11、βcdr3-asslvfgsvwdtqy        (seq id no:15)。

12、在另一优选例中，所述tcr包含tcrα链可变域和tcrβ链可变域，所述tcrα链可变域为与seq id no:1具有至少90％(例如可以是90％、92％、94％、95％、96％、98％或100％等)序列相同性的氨基酸序列；

13、和/或所述tcrβ链可变域为与seq id no:5具有至少90％(例如可以是90％、92％、94％、95％、96％、98％或100％等)序列相同性的氨基酸序列。

14、在另一优选例中，所述tcr包含α链可变域氨基酸序列seq id no:1。

15、在另一优选例中，所述tcr包含β链可变域氨基酸序列seq id no:5。

16、在另一优选例中，所述tcr为αβ异质二聚体，所述tcr包含tcrα链恒定区trac*01和tcrβ链恒定区trbc1*01或trbc2*01。

17、在另一优选例中，所述tcr的α链氨基酸序列为seq id no:3和/或所述tcr的β链氨基酸序列为seq id no:7。

18、在另一优选例中，所述tcr是人源的。

19、在另一优选例中，所述tcr是可溶的。

20、在另一优选例中，所述tcr是分离或纯化的。

21、在另一优选例中，所述tcr是可溶的。

22、在另一优选例中，所述tcr为单链。

23、在另一优选例中，所述tcr是由α链可变域与β链可变域通过肽连接序列连接而成。

24、在另一优选例中，所述tcr的α与β链的恒定区分别为鼠源的α与β链的恒定区。

25、在另一优选例中，所述tcr在α链可变区氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位，和/或α链j基因短肽氨基酸倒数第3位、倒数第5位或倒数第7位中具有一个或多个突变；和/或所述tcr在β链可变区氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94位，和/或β链j基因短肽氨基酸倒数第2位、倒数第4位或倒数第6位中具有一个或多个突变，其中氨基酸位置编号按imgt(国际免疫遗传学信息系统)中列出的位置编号。

26、在另一优选例中，所述tcr的α链可变域氨基酸序列包含seq id no:32和/或所述tcr的β链可变域氨基酸序列包含seq id no:34。

27、在另一优选例中，所述tcr的氨基酸序列为seq id no:30。

28、在另一优选例中，所述tcr包括(a)除跨膜结构域以外的全部或部分tcrα链；以及(b)除跨膜结构域以外的全部或部分tcrβ链；

29、并且(a)和(b)各自包含功能性可变结构域，或包含功能性可变结构域和所述tcr链恒定结构域的至少一部分。

30、在另一优选例中，半胱氨酸残基在所述tcr的α和β链恒定域之间形成人工二硫键。

31、在另一优选例中，在所述tcr中形成人工二硫键的半胱氨酸残基取代了选自下列的一组或多组位点：

32、trac*01外显子1的thr48和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser57；

33、trac*01外显子1的thr45和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser77；

34、trac*01外显子1的tyr10和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser17；

35、trac*01外显子1的thr45和trbc1*01或trbc2*01外显子1的asp59；

36、trac*01外显子1的ser15和trbc1*01或trbc2*01外显子1的glu15；

37、trac*01外显子1的arg53和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ser54；

38、trac*01外显子1的pro89和trbc1*01或trbc2*01外显子1的ala19；

39、或trac*01外显子1的tyr10和trbc1*01或trbc2*01外显子1的glu20。

40、在另一优选例中，所述tcr的α链氨基酸序列为seq id no:26和/或所述tcr的β链氨基酸序列为seq id no:28。

41、在另一优选例中，所述tcr的α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键。

42、在另一优选例中，在所述tcr中形成人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了选自下列的一组或多组位点：

43、trav的第46位氨基酸和trbc1*01或trbc2*01外显子1的第60位氨基酸；

44、trav的第47位氨基酸和trbc1*01或trbc2*01外显子1的等61位氨基酸；

45、trav的第46位氨基酸和trbc1*01或trbc2*01外显子1的第61位氨基酸；

46、或trav的第47位氨基酸和trbc1*01或trbc2*01外显子1的第60位氨基酸。

47、在另一优选例中，所述tcr包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域，但其不包含α链恒定域，所述tcr的α链可变域与β链形成异质二聚体。

48、在另一优选例中，所述tcr的α链和/或β链的c-或n-末端结合有偶联物。

49、在另一优选例中，与所述t细胞受体结合的偶联物包括可检测标记物、治疗剂、pk修饰部分或任何这些物质的组合。

50、优选地，所述治疗剂为抗-cd3抗体。

51、本发明的第二方面，提供了一种多价t细胞受体复合物，其包含至少两个t细胞受体分子，并且其中的至少一个t细胞受体分子为本发明第一方面所述的t细胞受体。

52、本发明的第三方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的t细胞受体的核苷酸序列，和/或编码本发明第一方面所述的t细胞受体的核苷酸序列的互补序列。

53、在另一优选例中，所述核酸分子是分离或纯化的。

54、在另一优选例中，所述核酸分子包含编码tcrα链可变域的核苷酸序列seq id no:2或seq id no:33。

55、在另一优选例中，所述核酸分子包含编码tcrβ链可变域的核苷酸序列seq id no:6或seq id no:35。

56、在另一优选例中，所述核酸分子包含编码tcrα链的核苷酸序列seq id no:4和/或包含编码tcrβ链的核苷酸序列seq id no:8。

57、本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第三方面所述的核酸分子。

58、优选地，所述载体为病毒载体。

59、更优选地，所述载体为慢病毒载体。

60、本发明的第五方面，提供了一种分离的宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第四方面所述的载体，或所述分离的宿主细胞的基因组中整合有外源的本发明第三方面所述的核酸分子。

61、本发明的第六方面，提供了一种细胞，所述细胞转导有本发明第三方面所述的核酸分子或本发明第四方面所述的载体。

62、优选地，所述细胞为t细胞、nk细胞、nkt细胞或干细胞。

63、本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的t细胞受体、本发明第二方面所述的多价t细胞受体复合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体或本发明第六方面所述的细胞中任意一种或至少两种的组合。

64、本发明的第八方面，提供了本发明第一方面所述的t细胞受体、本发明第二方面所述的多价t细胞受体复合物或本发明第六方面所述的细胞中任意一种或至少两种的组合的用途，所述用途包括制备治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物。

65、优选地，所述肿瘤为afp阳性肿瘤。

66、本发明的第九方面，提供了本发明第一方面所述的t细胞受体、本发明第二方面所述的多价t细胞受体复合物或本发明第六方面所述的细胞中任意一种或至少两种的组合用作治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物。

67、优选地，所述肿瘤为afp阳性肿瘤。

68、本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的t细胞受体、本发明第二方面所述的多价t细胞受体复合物、本发明第六方面所述的细胞或本发明第七方面所述的药物组合物中任意一种或至少两种的组合。

69、优选地，所述的疾病为肿瘤。

70、优选地，所述肿瘤为afp阳性肿瘤。

71、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

72、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

73、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

74、本发明的tcr能够与afp抗原短肽复合物tsselmaitr-hla a1101特异性结合，同时转导了本发明tcr的效应细胞能够被特异性激活。