基于数字PCR检验类慢病毒体中平均每个病毒颗粒中Cas9mRNA拷贝数的试剂盒的制作方法

基于数字pcr检验类慢病毒体中平均每个病毒颗粒中cas9 mrna拷贝数的试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种基于数字pcr检验类慢病毒体中平均每个病毒颗粒中cas9 mrna拷贝数的试剂盒，具体涉及一种双重荧光定量pcr，可在数字pcr平台中检测含cas9mrna的类慢病毒体平均每个病毒颗粒中cas9 mrna拷贝数的检验方法及试剂盒。


背景技术：

2.crispr-cas是继zfns、talens等基因编辑技术后的第三代基因编辑技术。因其基因编辑和基因修饰效率高、成本低、易用简便，目前已成为行业内最主流的基因编辑系统。crispr-cas系统一般由crispr基因座和cas基因(crispr关联基因)两部分组成。crispr基因座含有人工设计的grna(guide rna)用以识别目的基因序列，并引导cas9蛋白酶进行dna双链的切割，形成dna双链断裂。损伤的dna通过非同源末端连接方式(nhej)或同源重组修复(hdr)，从而实现基因的敲除或敲入。crispr-cas基因编辑系统应用广泛，已经在部分遗传性疾病显示出突出的治疗效果。
3.如何将crispr-cas基因编辑系统元件有效地递送至目的细胞，是当前热门的科学研究内容之一。目前，包括基于病毒载体和非病毒载体等多种策略被广泛用于crispr-cas系统的递送。在病毒载体中，aav是crispr体内基因编辑最常用的病毒递送载体，其拥有免疫原性低、靶向性好、基因编辑效率高等优势。然而受限于约4.7kb的aav的包装能力，同时包装spcas9，sgrna和目的基因序列很有挑战。慢病毒拥有更大的基因递送能力。基于慢病毒的改造的类病毒体(vlp)可将crispr-cas系统组件序列与目的序列包装于同一vlp中，如本导基因开发的类慢病毒体如help(hsv-1-erasing lentiviral particles，清除hsv-1类慢病毒体)。在help这类vlps中，crispr-cas9的两个重要元件sgrna和cas9，被包装在同一vlp类慢病毒体中但又分别位于病毒ssrna和cas9 mrna核酸中。通过该策略，该类vlp递送的基因可以在靶细胞内短期表达，可以产生高效的基因转导和编辑效率的同时又避免了cas9蛋白的长期表达带来的安全风险。然而，这类vlp类慢病毒体中cas9 mrna与类慢病毒ssrna基因组并不是呈固定比例(图1a)。包装元件的优化，病毒包装过程中各包装质粒载体比例等制备工艺的改变，都会导致vlp颗粒中cas9 mrna和ssrna的比例变化。cas9 mrna和ssrna的比例，直接影响产品在细胞内的基因编辑效率。因此，cas9 mrna在此类类慢病毒颗粒中的含量是该类产品质量重要的关注指标之一。基于qpcr和数字pcr开发的基因检测方法可对类慢病毒体进行cas9 mrna和ssrna拷贝数定量检测，进而获得产品中cas9 mrna相对拷贝数，为产品质量和功效评估提供重要支持。
4.在pcr扩增反应中因基因片段大小、扩增效率差异，多基因扩增常带来竞争性抑制，非等比扩增。因此，传统两基因的拷贝数定量检测采用分别制备两个基因的标准品，扩增体系，通过各自的标准曲线获得对应基因的起始拷贝数。这种方法在面对两个及两个以上待检基因数量时，工作操作量和试剂消耗量与待检基因数量呈正比关系。另外，由于需要
分别配制反应体系、标准品以及模板上样，因此任何环节的误差或失误均容易引起最终结果的波动，甚至是实验的整体失败。双重pcr、多重pcr可在同一检测体系中同时检测两个或多个目的基因。因此，基于数字pcr开发一种在同一反应体系中同时检测cas9 mrna和ssrna的定量检测方法，具备降低操作量、降低成本、降低误差等多种优势，显著提升检测效率、结果准确性和经济性。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种基于数字pcr检验类慢病毒体中平均每个病毒颗粒中cas9 mrna拷贝数的试剂盒。该试剂盒及检验方法可用于含crispr-cas9系统的基于慢病毒改造的类慢病毒体；是一种可检测这类病毒产品中平均每个病毒颗粒中含cas9 mrna拷贝数的试剂盒，具有准确性、稳定性、经济性、便捷性等优势。
6.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
7.《第一方面》
8.本发明提供一种用于检测类慢病毒体中平均每个病毒颗粒中cas9 mrna拷贝数的引物探针组合，包括特异性检验cas9 mrna的引物引物探针组以及特异性检验类慢病毒体ssrna基因组的引物探针组；
9.所述特异性检验cas9 mrna的引物引物探针组选自以下一组：
10.由如seq id no.1、2所示的引物对和seq id no.3所示的探针组成的组1，
11.由如seq id no.4、5所示的引物对和seq id no.6所示的探针组成的组2，
12.由如seq id no.7、8所示的引物对和seq id no.9所示的探针组成的组3，
13.由如seq id no.10、11所示的引物对和seq id no.12所示的探针组成的组4，
14.由如seq id no.13、14所示的引物对和seq id no.15所示的探针组成的组5，
15.由如seq id no.16、17所示的引物对和seq id no.18所示的探针组成的组6；
16.所述特异性检验类慢病毒体ssrna的引物探针组选自以下一组：
17.由如seq id no.19、20所示的引物对和seq id no.21所示的探针组成的组1，
18.由如seq id no.22、23所示的引物对和seq id no.24所示的探针组成的组2，
19.由如seq id no.25、26所示的引物对和seq id no.27所示的探针组成的组3，
20.由如seq id no.28、29所示的引物对和seq id no.30所示的探针组成的组4，
21.由如seq id no.31、32所示的引物对和seq id no.33所示的探针组成的组5。
22.作为一个实施方案，所述探针5’端标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团选自fam、hex、vic、rox或cy5。
23.作为一个实施方案，所述探针3’端标记有荧光淬灭集团，所述荧光淬灭集团选自mgb、bhq1、tamra、joe、bhq2或bhq3。
24.作为一个实施方案，所述特异性检验cas9的引物引物探针组由如seq id no.16、17所示的引物对和seq id no.18所示的探针组成，所述特异性检验类慢病毒体ssrna的引物探针组由如seq id no.25、26所示的引物对和seq id no.27所示的探针组成。
25.作为一个实施方案，所述探针5’端标记fam，3’端标记mgb。
26.作为一个实施方案，所述探针5’端标记hex，3’端标记bhq1。
27.《第二方面》
28.本发明提供一种检测类慢病毒体中平均每个病毒颗粒中cas9 mrna拷贝数的试剂盒，包括前述的引物探针组合。
29.作为一个实施方案，所述试剂盒还包括用于定量pcr使用的pcr反应所需的试剂。
30.作为一个实施方案，所述试剂盒还包括用于数字pcr使用的pcr反应所需的试剂。
31.作为一个实施方案，所述试剂盒用于检测含crispr-cas系统的类慢病毒体产品中的平均每个病毒颗粒中cas9 mrna拷贝数。
32.《第三方面》
33.本发明提供一种检测含crispr-cas系统的类慢病毒体中平均每个病毒颗粒中cas9 mrna拷贝数的方法，包括如下步骤：
34.s1、核酸酶消化处理类慢病毒体后进行病毒核酸提取，rna逆转录cdna；
35.s2、以获得的cdna为模板，结合所述特异性检验cas9 mrna的引物引物探针组以及特异性检验类慢病毒体ssrna基因组的引物探针组进行数字pcr反应，检测得到cas9 mrna拷贝数和ssrna拷贝数；
36.s3、按下述公式获得平均每个病毒颗粒的cas9 mrna拷贝数：
37.平均每个病毒颗粒的cas9 mrna拷贝数＝cas9 mrna拷贝数/[ssrna拷贝数/2]。
[0038]
步骤s2中，所述引物探针组合选用由如seq id no.16、17所示的引物对和seq id no.18所示的探针组成的特异性检验cas9 mrna的引物引物探针组，以及由如seq id no.25、26所示的引物对和seq id no.27所示的探针组成的特异性检验类慢病毒体ssrna基因组的引物探针组。
[0039]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0040]
1)本发明建立了一种类慢病毒体平均每个病毒颗粒中cas9 mrna拷贝数的检验方法及试剂盒。该方法及试剂盒通过提取类慢病毒rna核酸，然后逆转录成cdna后运用数字pcr方法检测cas9 mrna和ssrna拷贝数，通过计算公式cas9 mrna拷贝数/[ssrna拷贝数/2]进而获得平均每个病毒颗粒的cas9 mrna拷贝数。
[0041]
2)本发明的检验方法及试剂盒采用双重荧光定量pcr的方法，相比传统的单分子、单荧光基团扩增技术，具备降低成本、减少操作、结果准确稳定的优点。
[0042]
3)本发明的检验方法及试剂盒，可基于数字pcr检测平台从而无需制备标准曲线，具备良好的检测准确性。
[0043]
4)本发明检验方法及试剂盒，可以特异性地结合cas9序列，定量检测cas9 mrna拷贝数。
[0044]
5)本发明检验方法及试剂盒，可以特异性地结合类慢病毒体ssrna序列，定量检测ssrna拷贝数。
[0045]
6)本发明检验方法及试剂盒，通过方法学评估证明具备良好的准确性和稳定性。
附图说明
[0046]
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0047]
图1a为类慢病毒体的结构示意图；图1b cas9和ssrna引物探针设计区域示意图；
[0048]
图2为数字pcr中不同ssrna引物探针阳性微滴检测结果；
[0049]
图3为数字pcr中不同cas9引物探针阳性微滴检测结果；
[0050]
图4为代表性样本(help1-1)双重荧光检测与单重荧光检测阳性微滴检测结果对比；
[0051]
图5为基于数字pcr的专属性评估的微滴检测结果。
具体实施方式
[0052]
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0053]
本发明涉及的平均每个类慢病毒体病毒颗粒中cas9 mrna拷贝数检测的检验方法及试剂盒包括：
[0054]
实施例1：类慢病毒体cas9 mrna和ssrna引物、探针设计
[0055]
步骤：为了检测cas9 mrna与类慢病毒ssrna基因拷贝数，分别在这两条rna序列上进行引物探针的设计(图1b)。为达到同一反应中可同时进行cas9 mrna和ssrna拷贝数检测的目的，ssrna的探针选择fam基团，cas9探针选择vic基团。设计好的引物探针交由擎科生物公司合成。
[0056]
cas9引物探针组合设计区域序列如seq id no.34所示。
[0057]
类慢病毒ssrna引物探针组合的设计区域序列如seq id no.35所示。
[0058]
结果：本项目根据引物、探针设计的基本原则，共挑选共6对位于cas9序列不同区域的cas9引物探针组合，5对位于ssrna序列中的不同区域的ssrna引物探针组合。引物探针信息如下表。
[0059][0060][0061]
实施例2：ssrna引物探针组合的优选
[0062]
步骤:
[0063]
1.取出lenticrispr v2定量标准品，按照10倍梯度稀释的原则，使用rnase-free水稀释6个梯度，标记为s1、s2、s3、s4、s5、s6。选用s6作为检测模板进行使用。
[0064]
2.数字pcr反应体系的制备
[0065]
2.1提前取出数字pcr预混液、引物探针置于冰上化，轻微振荡混匀，快速离心。根据反应总量配制数字pcr mix。在此步骤中，分别配制ssrna-1和cas9-2,ssrna-2和cas9-2,ssrna-3和cas9-2,ssrna-4和cas9-2,ssrna-5和cas9-2反应液组合。
[0066]
名称单孔体积(μl)微滴式数字pcr用反应预混液7.5ssrna-f0.6ssrna-r0.6ssrna-probe0.3cas9-2f0.6cas9-2r0.6cas9-2probe0.3
[0067]
2.2根据样品量取所需数量的200μlep管并做好标记。
[0068]
2.3将5.1配好的数字pcr mix分装至5.2标记好的200μlep管内，每管10.5μl。
[0069]
2.4取样本cdna，进行100倍稀释。
[0070]
2.5稀释后的样本取4.5μl作为模板进行上样检测，加样完成后每孔总体积应为15μl。
[0071]
2.6取出数字pcr微滴式芯片移至生物安全柜，将芯片封膜取掉，观察每孔的油量是否相平，若个别孔内油量相对较少，便用配送的油进行补齐。
[0072]
2.7确认2.6无问题，便依次取14μl样本在蓝点那一排孔垂直缓慢加样，加样时尽量避免气泡产生。
[0073]
2.8完成2.7，确保塞子上的孔是否通气，在用手捏住塞子两侧将孔口塞住，盖塞子时切勿用手直接按压塞子通气孔处。
[0074]
3.上机
[0075]
3.1将加了样的芯片放置dg32样本制备仪盖好盖子点击启动进行制备生成数字pcr样本。
[0076]
3.2待3.1生成样本后，将芯片转移至tc1 pcr扩增仪。
[0077]
3.3设置反应程序：95℃预变性5min；95℃15s，60℃60s，40个循环。
[0078]
3.4点击运行，等到运行时间跳出1h30min确认无误时方可离开。
[0079]
3.5待3.4运行结束后，将芯片转移至cs3生物芯片阅读仪。
[0080]
3.6在电脑上选择创建项目，输入项目名称，选择fam、vic通道，定位通道选择vic。
[0081]
3.7点击拍照，会进行5min拍照倒计时，5min之后自动进行拍照。
[0082]
3.8待3.7拍照结束后点击图像分析，输出fam和vic拷贝数结果。
[0083]
结果：
[0084]
基于cas9-2的双重荧光扩增检测实验结果显示，不同的ssrna引物探针组合在检测相同样本其检测结果有不同。如图2，在ssrna组合1-5中，ssrna-1，ssrna-4受到较大的扩增影响，相同的样本ssrna-2，ssrna-3和ssrna-5有更高的检测值，三组组合结果相近。根据
阳性液滴相比阴性液滴的基线荧光值，ssrna-3和ssrna-5有更好的荧光分离度。因此，我们选择ssrna-3引物探针组合作为优选的ssrna引物探针组合用于后续检测。
[0085]
探针荧光引物探针组合vic浓度(copies/ul)fam浓度(copies/ul)vic+famssrna-1+cas9-22.8163.907vic+famssrna-2+cas9-22.60818.51vic+famssrna-3+cas9-21.68215.568vic+famssrna-4+cas9-22.79511.766vic+famssrna-5+cas9-22.10514.398
[0086]
实施例3：cas9引物探针组合的优选
[0087]
步骤：
[0088]
1.取出lenticrispr v2定量标准品，按照10倍梯度稀释的原则，使用rnase-free水稀释4个梯度，标记为s1、s2、s3、s4。选用s4作为检测模板进行使用。
[0089]
2.数字pcr反应体系的制备
[0090]
2.1提前取出数字pcr预混液、引物探针置于冰上化，轻微振荡混匀，快速离心。根据反应总量配制数字pcr mix。在此步骤中，分别配制cas9-1和ssrna-3,cas9-2和ssrna-3，cas9-3和ssrna-3，cas9-4和ssrna-3，cas9-5和ssrna-3，cas9-6和ssrna-3反应液组合。以及ssrna，cas9 1-5各引物探针组合各自的单重荧光扩增体系。
[0091]
2.2数字pcr的其他制备步骤，上机检测步骤参考实施例2的2.2-2.8。
[0092][0093]
结果：
[0094]
如图3实验结果显示，cas9引物探针组合1-6中，cas9-1和cas9-5无论是单独扩增还是和ssrna双重扩增，均无有效结果产生，表明这两套引物探针组合不适用于数字pcr检测体系。在剩下的cas9-2，cas9-3，cas9-4，cas9-6可以检测到荧光产物。我们进一步分析了剩下4套引物探针组合在单重荧光扩增检测与双重荧光扩增检测的差异。cas9-2在双重荧光扩增检测中严重受到抑制，无有效vic信号产生。cas9-4当采用双重荧光扩增检测时，cas9和ssrna均受到扩增抑制，产物仅为单基因扩增检测的量一半。
[0095]
综合评估下来，当使用ssrna-3作为类慢病毒ssrna检测的引物探针组合时，cas9-3和cas9-6有更好的双重荧光定量检测的优势。最终，我们优选ssrna-3和cas9-6作为我们
双重荧光定量的优选引物探针组合。
[0096][0097][0098]
实施例4：单重荧光扩增检测结果双重荧光检测结果差异
[0099]
1.病毒准备工作
[0100]
1.1病毒包装：类慢病毒体的包装、生产和纯化，具体参数与包装步骤可参考文献《lentiviral delivery of co-packaged cas9 mrna and a vegfa-targeting guide rna prevents wet age-related macular degeneration in mice》。根据不同的质粒比例，获得了6份不同的类慢病毒体help。
[0101]
2.核酸酶消化处理：若待检样本为未浓缩病毒，则取病毒上清100μl，加入核酸酶1μl。混匀后室温消化10min，消化过程中涡旋混匀1次。若待检为病毒浓缩液，则取病毒液10μl，加入pbs溶液90μl。按终浓度100u/ml加入核酸酶1ul，混匀后37℃消化30min。本实施例中取病毒液10μl，加入pbs溶液90μl。随后按终浓度100u/ml加入核酸酶1ul，混匀后37℃消化30min。
[0102]
3.病毒核酸提取
[0103]
3.1消化后的病毒样本，短暂离心后加入pbs溶液99μl，补齐至200μl。
[0104]
3.2取1.5ml rnase-free离心管，依次加入600μl lysis buffer，20μlmgpure beads(使用前充分混匀)，200μl样本，涡旋混匀后60℃孵育10min。孵育过程中涡旋混匀2～3次。
[0105]
3.3将样品管置于磁力架上静置几分钟，待溶液完全澄清后小心吸弃所有液体。
[0106]
3.4样品管敞口在空气中晾干5min。
[0107]
3.5将样品管从磁力架上取出，加入80μl depc-treated水，移液器吹打重悬磁珠，70℃孵育3min。
[0108]
3.6取对应数量的1.5ml rnase-free离心管，做好样本标记，并于各管中加入rna核酸酶抑制剂rnase inhibitor 1μl。
[0109]
3.7将样品管再次置于磁力架上，待溶液完全澄清后，小心转移液体至标记好的
rnase-free离心管中。
[0110]
3.8所得核酸样本可置于-80℃冰箱保存备用。
[0111]
4.rna逆转录cdna
[0112]
4.1基因组dna去除：在rnase-free离心管中配制如下混合液：
[0113]
成分名称每管用量5
×
gdna wiper mix4.0μltotal rna5.0μlrnase-free ddh2o1.0μl
[0114]
4.2每管分装5.0μl，加入样本rna 5.0μl，用移液枪轻轻吹打混匀。42℃反应2min。
[0115]
4.3配制第一链cdna合成反应液：在rnase-free离心管中配制如下混合液：
[0116]
成分名称每管用量10
×
rt mix2.0μlhiscript ii enzyme mix2.0μlrnase-free ddh2o6.0μl上一步的混合液10.0μl
[0117]
4.4混合液配制完成后，向上一步的混合液中加入10.0μl的逆转录mix，用移液器轻轻吹打混匀。
[0118]
4.5逆转录反应于50℃进行15min，85℃进行1分钟。
[0119]
4.6反应产物加入te溶液80μl。产物于-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。
[0120]
5.数字pcr反应体系的制备
[0121]
5.1提前取出数字pcr预混液、引物探针置于冰上化，轻微振荡混匀，快速离心。根据反应总量配制数字pcr mix。
[0122][0123][0124]
5.2根据样品量取所需数量的200μlep管并做好标记。
[0125]
5.3将5.1配好的数字pcr mix分装至5.2标记好的200μlep管内，每管10.5μl。
[0126]
5.4取4.6的样本cdna，进行100倍稀释。
[0127]
5.5稀释后的样本取4.5μl作为模板进行上样检测，加样完成后每孔总体积应为15
μl。
[0128]
5.6取出数字pcr微滴式芯片移至生物安全柜，将芯片封膜取掉，观察每孔的油量是否相平，若个别孔内油量相对较少，便用配送的油进行补齐。
[0129]
5.7确认5.6无问题，便依次取14μl样本在蓝点那一排孔垂直缓慢加样，加样时尽量避免气泡产生。
[0130]
5.8完成5.7，确保塞子上的孔是否通气，在用手捏住塞子两侧将孔口塞住，盖塞子时切勿用手直接按压塞子通气孔处。
[0131]
6.上机
[0132]
6.1将加了样的芯片放置dg32样本制备仪盖好盖子点击启动进行制备生成数字pcr样本。
[0133]
6.2待6.1生成样本后，将芯片转移至tc1 pcr扩增仪。
[0134]
6.3设置反应程序：95℃预变性5min；95℃15s，60℃60s，40个循环。
[0135]
6.4点击运行，等到运行时间跳出1h30min确认无误时方可离开。
[0136]
6.5待6.4运行结束后，将芯片转移至cs3生物芯片阅读仪。
[0137]
6.6在电脑上选择创建项目，输入项目名称，选择fam,vic通道，定位通道选择vic。
[0138]
6.7点击拍照，会进行5min拍照倒计时，5min之后自动进行拍照。
[0139]
6.8待6.7拍照结束后点击图像分析，输出fam和vic拷贝数结果。
[0140]
7.结果分析
[0141]
7.1平均每个类慢病毒颗粒的cas9 mrna拷贝数计算公式：cas9 mrna拷贝数(拷贝/病毒)＝cas9 mrna拷贝数(vic)/[ssrna拷贝数(fam)/2]。
[0142]
结果：
[0143]
使用优选的ssrna-3和cas9-6引物探针组合，对6份不同质粒比例包装的help病毒进行了两基因的拷贝数检测。为了评估双重荧光和单重荧光的检测结果差异，分别设置了两个基因同时检测的双荧光定量检测以及两个基因分开的单荧光定量检测。
[0144]
如图4，当使用双基因扩增检测时，6个类慢病毒体样本的平均每个病毒包含的cas9 mrna拷贝数在0.40～1.90间波动。使用单基因的检测方法，结果显示6个类慢病毒体样本的平均每个病毒包含的cas9 mrna拷贝数在0.30～1.88间波动。不同组间的拷贝数差异，表明不同的质粒比例包装对类病毒终产品中cas9 mrna拷贝数含量影响很大。
[0145]
进一步分析两种模式的检测结果，结果显示使用双重荧光检测的结果和单重荧光的结果比值差距于0.75～0.99间波动，两组数据的cv均低于15％。表明两者的检测结果非常接近，有很好的一致性。使用双基因双荧光的双重检测不会受到明显的扩增抑制影响。
[0146][0147]
实施例6、优选引物探针组合的专属性评估
[0148]
步骤：
[0149]
1.取出lenticrispr v2定量标准品，按照10倍梯度稀释的原则，使用rnase-free水稀释5个梯度，标记为s1、s2、s3、s4、s5。选用s5作为阳性对照模板使用。
[0150]
2.提取293t细胞基因组，提取的基因组dna作为阴性对照模板使用。
[0151]
3.使用质粒模板s4 30ul和293t基因组70ul进行混合，制备成阳性对照模板使用。
[0152]
4.按照实施例4中制备数字pcr mix和上机检测。
[0153]
结果：
[0154]
对优选的cas9-6和ssrna-3引物探针组合，分别对阳性组dna和阴性dna扩增。如图5结果显示优选的引物探针组合，在扩增阳性对照组1和阳性对照组2中，均能有效扩增和检测。当无目的基因存在的293t和ntc阴性对照组中，只能检测到极低的基因拷贝，主要考虑为操作过程中的少量模板污染。结果表明优选的cas9-6和ssrna-3引物探针组合有良好的专属性。
[0155][0156]
综上所述，本发明经过深入的研究和创造性的劳动，得到了检验类慢病毒体，如help病毒，平均每个病毒颗粒中的cas9 mrna拷贝数的引物探针组合。在此基础上，得到了基于数字pcr测定类慢病毒体中cas9 mrna拷贝数的的检验方法和试剂盒。本发明的方法或试剂盒能够准确测定类慢病毒体群体水平中，平均每个病毒颗粒中包含的cas9的拷贝数，用于评估类慢病毒体中的crispr-cas系统中关键元件的含量。
[0157]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。