用于ETV6-NTRK3基因融合突变ddPCR检测的探针引物组及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学，具体涉及用于etv6-ntrk3基因融合突变ddpcr检测的探针引物组及其应用。

背景技术：

1、etv6-ntrk3融合突变最初是在研究先天性纤维肉瘤具有的染色体重排t(12；15)(p13；q25)时发现的，该融合能够编码etv6蛋白的螺旋-环-螺旋结构域与ntrk3的蛋白酪氨酸激酶结构域连接在一起的融合蛋白。并且该融合蛋白可参与多种信号级联放大相连接。研究发现，一种功能性的胰岛素生长因子1受体和高重复序列的多聚体在etv6-ntrk3融合基因的致癌性中起着重要作用，目前多种肿瘤中均检测到该融合，如先天性纤维肉瘤、先天中胚层肾瘤、白血病，乳腺癌等，因此探讨该融合引起肿瘤发生的可能分子生物学机制，同时初步探讨该融合基因在临床诊断、临床治疗及预后判断等方面的价值成为当前临川的迫切需求，其中etv6∶exon5-ntrk3∶exon15属于etv6-ntrk3融合突变的一种。

2、当前市场etv6∶exon5-ntrk3∶exon15检测主要基于fish与qpcr的技术，然而fish技术存在操作复杂；而qpcr技术受胆红素与血红蛋白的影响较大，同时也无法完全满足临床对该融合灵敏度的要求。

技术实现思路

1、本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供用于etv6-ntrk3基因融合突变ddpcr检测的探针引物组。

2、本发明的另一目的在于提供一种etv6∶exon5-ntrk3∶exon15基因融合ddpcr检测试剂盒。

3、本发明的再一目的在于提供上述探针引物组在制备etv6∶exon5-ntrk3∶exon15基因融合ddpcr检测试剂盒中的应用。

4、本发明的技术方案如下：

5、用于etv6-ntrk3基因融合突变ddpcr检测的探针引物组，包括从rna层面设计的探针、上游引物和下游引物，其序列依次如seq id no.01至03所示，探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团。

6、在本发明的一个优选实施方案中，由所述探针、上游引物和下游引物组成。

7、在本发明的一个优选实施方案中，所述荧光基团为6-fam。

8、进一步优选的，所述猝灭基团为mgb。

9、本发明的另一技术方案如下：

10、一种etv6∶exon5-ntrk3∶exon15基因融合ddpcr检测试剂盒，具有上述探针引物组。

11、在本发明的一个优选实施方案中，20μl的ddpcr反应液中，所述探针的用量为5nmol，所述上游引物和下游引物的用量均为10nmol。

12、在本发明的一个优选实施方案中，ddpcr的反应程序如下表所示：

13、

14、本发明的再一技术方案如下：

15、上述探针引物组在制备etv6∶exon5-ntrk3∶exon15基因融合ddpcr检测试剂盒中的应用。

16、在本发明的一个优选实施方案中，20μl的ddpcr反应液中，所述探针的用量为5nmol，所述上游引物和下游引物的用量均为10nmol。

17、在本发明的一个优选实施方案中，ddpcr的反应程序如下表所示：

18、

19、本发明的有益效果是：

20、1、本发明灵敏度高，可支持低至20copies的etv6∶exon5-ntrk3∶exon15融合检出。

21、2、本发明线性好，梯度稀释后r2大于0.99。

22、3、本发明覆盖全面，其中的探针和引物从rna层面设计，避免了dna层面断点不固定的问题，能够覆盖dna层面etv6第5内含子的所有断点与ntrk3第14内含子所有断点形成的融合。

技术特征：

1.用于etv6-ntrk3基因融合突变ddpcr检测的探针引物组，其特征在于：包括从rna层面设计的探针、上游引物和下游引物，其序列依次如seq id no.01至03所示，探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团。

2.如权利要求1所述的探针引物组，其特征在于：由所述探针、上游引物和下游引物组成。

3.如权利要求1或2所述的探针引物组，其特征在于：所述荧光基团为6-fam。

4.如权利要求3所述的探针引物组，其特征在于：所述猝灭基团为mgb。

5.一种etv6：exon5-ntrk3：exon15基因融合ddpcr检测试剂盒，其特征在于：具有权利要求1至4中任一权利要求所述的探针引物组。

6.如权利要求5所述的一种etv6：exon5-ntrk3：exon15基因融合ddpcr检测试剂盒，其特征在于：20μl的ddpcr反应液中，所述探针的用量为5nmol，所述上游引物和下游引物的用量均为10nmol。

7.如权利要求5或6所述的一种etv6：exon5-ntrk3：exon15基因融合ddpcr检测试剂盒，其特征在于：ddpcr的反应程序如下表所示：

8.权利要求1至4中任一权利要求所述的探针引物组在制备etv6：exon5-ntrk3：exon15基因融合ddpcr检测试剂盒中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：20μl的ddpcr反应液中，所述探针的用量为5nmol，所述上游引物和下游引物的用量均为10nmol。

10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于：ddpcr的反应程序如下表所示：

技术总结
本发明公开了用于ETV6‑NTRK3基因融合突变ddPCR检测的探针引物组，包括从RNA层面设计的探针、上游引物和下游引物，其序列依次如SEQ ID NO.01至03所示，探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团。本发明覆盖全面，其中的探针和引物从RNA层面设计，避免了DNA层面断点不固定的问题，能够覆盖DNA层面ETV6第5内含子的所有断点与NTRK3第14内含子所有断点形成的融合；灵敏度高，可支持低至20copies的ETV6：exon5‑NTRK3：exon15融合检出；线性好，梯度稀释后R<supgt;2</supgt;大于0.99。

技术研发人员：洪强,赵静波,傅烨霖,金保雷,董华,郑方克,罗捷敏,郑立谋
受保护的技术使用者：上海厦维医学检验实验室有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15