抗磷脂酰胆碱抗体及制备方法与可变区序列及应用与流程

本发明属于生物，涉及抗磷脂酰胆碱抗体，尤其涉及一种抗磷脂酰胆碱抗体及制备方法与可变区序列及应用。

背景技术：

1、胆碱是带正电荷的四价碱基，在胞浆中的浓度为8～25微摩尔/升，在脑中浓度为25～50纳摩尔/升。机体内胆碱主要以磷脂酰胆碱(phosphatidyl cholines，pc)的形式存在，或者由内源性合成的pc而来。机体除了从作为大分子pc的一部分来取得胆碱外，不能通过其他途径生成胆碱。磷脂酰胆碱占据了哺乳动物质膜的磷脂的50％以上，并且特别富含于细胞外小叶中。pc在肝脏中合成，是脂蛋白组装和分泌所必需的。

2、磷脂酰胆碱是一种两性分子，由亲水的头部和疏水的尾部组成，是磷脂的一种，在头部插有一个胆碱基团。狭义上，磷脂酰胆碱一般指卵磷脂，存在于动植物组织及卵黄中的一种黄褐色的油脂性物质。构成成分包括磷酸、胆碱、脂肪酸、甘油、糖脂、甘油三酸酯及磷脂。是细胞膜、肺泡表面活性物质、脂蛋白和胆汁的重要组成成分，在磷脂双分子层的外叶上更为常见，也是脂质信使如溶血磷脂酰胆碱、磷脂酸、甘油二酯、溶血磷脂酸和花生四烯酸的来源。虽然所有的动植物细胞中都含有磷脂酰胆碱，但是大多数细菌细胞是不含磷脂酰胆碱的，比如大肠杆菌。

3、磷脂酰胆碱作为生物膜的重要成分，也常常被视作临床诊断的可行性补充以及医药保健品。有研究发现磷脂酰胆碱与急性心肌梗死的风险降低有关，磷脂酰胆碱或可成为潜在的急性心肌梗死诊断的生物标志物。溶血磷脂酰胆碱(lyspphosphatidylcholines，lpcs)是磷脂的一种，又称溶血卵磷脂，是磷脂酰胆碱在磷脂酶的作用下产生的，同磷酸酰胆碱具有较大的结构相似性，研究发现溶血磷脂酰胆碱同肝脏疾病、肾脏疾病、肿瘤、心血管疾病等密切相关，或可成为潜在诊断生物标志物使用。

4、国内目前尚未发现有单独的抗磷脂酰胆碱抗体，多以抗磷脂抗体的形式存在。磷脂酰胆碱的检测在国内并未完全开展，其检测往往通过色谱/质谱等方式进行，对专业性要求较高，仅有极少数的科研级别的试剂盒提供，且试剂盒的质量较差，可能存在着严重的交叉检测干扰。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种抗磷脂酰胆碱抗体及制备方法与可变区序列及应用，本发明首先提供了一株优质的抗天然磷脂酰胆碱的抗体。

2、其次，本发明提供了一种免疫检测中血细胞的清除试剂。

3、再次，本发明提供了抗天然磷脂酰胆碱抗体的可变区序列。

4、最后，本发明提供了抗天然磷脂酰胆碱抗体的重组抗体。

5、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

6、本发明首先提供的抗磷脂酰胆碱抗体的制备方法，包括以下步骤：

7、1)以红细胞膜的碎片作为免疫原，提取得到红细胞膜后，对红细胞膜稀释，配合q佐剂对小鼠进行腹腔多次免疫，获得免疫滴度满足细胞融合要求的免疫小鼠；

8、2)具有较高免疫滴度的小鼠进行细胞融合，并进行检测，保留具有阳性的细胞株；

9、3)具有阳性的细胞株进行红细胞凝集效果测试，保留对红细胞凝集效果较好的细胞株，最终保留具有全凝集效果的细胞株；

10、4)抗体纯化：收集对红细胞具有全凝集效果的细胞株的培养上清液，对保留的细胞培养上清液进行蛋白a的亲和层析纯化，获得纯化抗体，命名为mbc-xx经测试后保留最佳的两株细胞株，得到抗磷脂酰胆碱抗体mbc02或mbc03。

11、作为本发明的一种优选方案，所述红细胞碎片为人红细胞膜的碎片。

12、作为本发明的一种优选方案，mbc02的抗体为亚型为igg3_kappa鼠单抗。

13、本发明的抗磷脂酰胆碱抗体可以作为免疫检测中血细胞的清除试剂，本发明根据红细胞等细胞的生物膜结构特性，基于红细胞在凝血因子等作用下会发生凝血的天然特性，根据其血凝特点开发快速获得抗红细胞抗体的方法，并筛选获得能够完全清除生物膜的试剂。

14、本发明还提供了采用上述的制备方法得到的抗磷脂酰胆碱抗体。

15、作为本发明的一种优选方案，所述抗磷脂酰胆碱抗体的轻链可变区核酸序列如seq id no:1所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no:2所示。

16、作为本发明的一种优选方案，所述抗磷脂酰胆碱抗体的重链的可变区核酸序列如seq id no:3所示，重链可变区氨基酸序列如seq id no:4所示。

17、本发明还提供了一种体外重组抗磷脂酰胆碱抗体，通过上述的抗磷脂酰胆碱抗体轻链和重链的可变区的特异性序列与igg3_kappa、鼠igm恒定区骨架序列，进行整合并构建表达载体，进行质粒dna的转染，获得体外重组抗磷脂酰胆碱抗体，所述抗磷脂酰胆碱抗体为mbc02。

18、作为本发明的一种优选方案，合成的mbc02_igg3_kappa轻链的核苷酸序列如seqid no:9所示，翻译后的成熟的轻链完整氨基酸序列如seq id no:10所示，额外添加的信号肽的核苷酸序列如seq id no:11所示；

19、合成的mbc02_igg3_kappa重链的核苷酸序列如seq id no:13所示，翻译后的成熟的重链完整氨基酸序列如seq id no:14所示，额外添加的信号肽的核苷酸序列如seq idno:15所示。

20、作为本发明的一种优选方案，合成的mbc02_igm_kappa轻链的核苷酸序列如seqid no:16所示，翻译后的成熟的轻链完整氨基酸序列如seq id no:17所示，额外添加的信号肽的核苷酸序列如seq id no:18所示；

21、合成的mbc02_igm_kappa重链的核苷酸序列如seq id no:19所示，翻译后的成熟的重链完整氨基酸序列如seq id no:20所示，额外添加的信号肽的核苷酸序列如seq idno:21所示。

22、本发明还提供了体外重组抗磷脂酰胆碱抗体的应用，所述体外重组抗磷脂酰胆碱抗体在将igg型的抗磷酸酰胆碱抗体改造为不含有j链的igm型抗体上的应用，以及在下游制备磷脂酰胆碱的检测试剂盒中的应用。

23、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

24、1)本发明制得了mcb02、mbc03抗体，其中mbc02效果最为突出，经测试为抗磷酸酰胆碱抗体。

25、2)本发明制得的抗磷脂酰胆碱抗体mbc02不仅能够作为磷脂酰胆碱的检测试剂使用，填补了上面上缺乏磷酸酰胆碱检测试剂的空白，还能够清除免疫检测中生物膜的干扰。

26、3)本发明磷酸酰胆碱抗体具有作为急性心肌梗死、肝肾疾病、肿瘤等代谢以及心血管疾病的诊断试剂的潜在应用性。

27、4)本发明获得了抗磷酸酰胆碱抗体mbc02的可变区序列，并成功获得体外重组的cmbc02_igg抗体和稳定转染株，重组抗体具有同mbc02等价的效果，为后期的大量使用做好了准备，也避免了腹水抗体生产中可能出现的各种不确定因素。

28、5)本发明获得了体外重组的cmb02_igm改造抗体，能够明显提高检测活性以及检测磷酸酰胆碱的灵敏度，同时获得稳定转染株，方便后期的大量使用。

29、6)本发明重组的cmbc02_igm不含有j链，表达蛋白为聚体形式，且多以六聚体的形式存在，能够进一步提高免疫检测时抗原的结合；不含j链的igm转染和表达更容易，也更容易筛选到稳定转染株，同时表达量也较含j链的igm更高。

30、7)本发明重组的cmbc02_igm较由细胞融合获得杂交瘤细胞所产生的抗体性能更稳定、获取更方便，igm型抗体在动物体内不稳定且存在周期很短，获得优质的天然igm型抗体较为困难，多数天然igm型抗体存在测试活性较差、保存不稳定的普遍特性；而经由igg改造的重组igm的获得更为方便和直接，且能够根据需求表达为不含j链的六聚体结构，其在检测和治疗领域已经开始尝试应用。