多特异性结合蛋白降解剂平台及使用方法与流程

本公开涉及一种用于细胞表面蛋白的靶向降解的多特异性抗体平台。本公开涉及靶向至少一种跨膜e3泛素连接酶蛋白和至少一种细胞表面蛋白例如旨在供降解的细胞表面蛋白的多特异性(例如，双特异性或三特异性)结合分子诸如多特异性抗体，以及使用其的方法。

背景技术：

1、出于靶向对目标蛋白的降解的目的，已经构建了各种平台。例如，protac(蛋白水解靶向嵌合体)是旨在将胞质蛋白靶向26s蛋白体以进行降解的小分子构建体。它们可以包括与泛素e3连接酶结合的结构域、与靶向降解的蛋白质(即，目标蛋白)结合的结构域和连接这两个结合结构域的接头分子。然而，protac靶向胞质蛋白结构域，从而意味着该方法不能与某些膜结合的靶标或细胞表面蛋白靶标一起使用。(参见例如，ahn等人,chemrxiv,doi.org/10.26434/chemrxiv.12736778.v1,2020年7月30日发布。)例如，lytac(溶酶体靶向嵌合体)构建体是与目标膜蛋白结合并且还包括配体诸如与阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(ci-m6pr)结合的甘露糖-6-膦酸酯的多价构建体。将靶向的膜蛋白与ci-m6pr连接将蛋白质带到溶酶体以进行降解。(参见同上。)然而，与protac不同的是，lytac需要化学偶联(例如，与甘露糖-6-膦酸酯)，这可能需要在制造期间进行控制，诸如以避免产物异质性。另外，由于ci-m6pr在几乎所有组织中都有表达，因此该技术可能无法用于选择性地降解一个或多个特定组织中的蛋白质。cotton等人描述了一种结合细胞表面e3泛素连接酶rnf43和细胞表面免疫检查点蛋白pd-l1的双特异性抗体(j.am.chem.soc.2021，可在https://dx.doi.org/10.1021/jacs.0c10008获得)。证明了在体外暴露于双特异性抗体的肿瘤细胞系中pd-l1的溶酶体降解。wo2021/176034描述了双特异性单链(vhh)“抗标签”抗体，所述抗体能够降解hek293t细胞中瞬时表达的带标签细胞表面蛋白，所述细胞也瞬时表达了带标签的e3连接酶。然而，方法的一般适用性(包括降解表达内源性e3连接酶的细胞中的内源性细胞表面蛋白的效率以及体内有效性)以及利用针对细胞表面连接酶的抗体的平台的最佳属性仍然是未知的。

技术实现思路

1、本公开涉及一种用于膜结合蛋白和细胞表面蛋白的靶向降解的改进的方法，所述改进的方法使用多特异性结合蛋白，诸如与至少一种跨膜e3泛素连接酶诸如rnf43或znrf3或者诸如rnf128、rnf130、rnf133、rnf148、rnf149、rnf150、rnf167或znrf4或其他细胞表面连接酶以及与旨在供降解的细胞表面蛋白结合的多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体。多特异性结合蛋白使用跨膜e3泛素连接酶例如将目标细胞表面蛋白靶向溶酶体以进行降解。锌和环指3(znrf3)及其同源物环指43(rnf43)是通常促进细胞表面上的卷曲(fzd)受体和lrp6受体的降解和转换的示例性跨膜e3泛素连接酶(hao等人,nature 485:195-200(2012)；koo等人,nature 488:665-669(2012))。rnf43和znrf3还是wnt信号传导通路的成员，所述wnt信号传导通路例如在某些类型的癌症中可以被活化。(参见例如图1c。)因此，与其他细胞相比，来自各种癌症的肿瘤细胞可以表达相对高水平的rnf43和znrf3，这在一些实施方案中可以允许选择性地降解肿瘤细胞中的靶蛋白。多种其他跨膜e3泛素连接酶也可以用作本文的多特异性结合蛋白的靶标。本文还提供了多特异性抗体的最佳属性(包括例如优化的结合亲和力和多特异性形式)。在一些实施方案中，本文的多特异性结合蛋白被称为protab(“蛋白水解靶向抗体”)。

2、除了提供靶向跨膜e3泛素连接酶和用于破坏的细胞表面蛋白的多特异性结合蛋白的一般平台外，本公开还提供了靶向可用于构建这种多特异性抗体和结合蛋白的rnf43或znrf3的多种抗体重链和轻链可变区。在一些实施方案中，本文的结合蛋白可以在治疗上使用例如以降解有助于疾病进展的蛋白质，例如但不限于在wnt通路在其中被活化并且表达跨膜e3泛素连接酶的细胞中。例如，某些癌症诸如结直肠癌(crc)的特征在于rnf43和znrf3的过表达。因此，由于细胞对这些蛋白质的过表达，可以使本文中靶向这些连接酶中的一种或两种的多特异性结合蛋白选择性地靶向癌细胞。本文的结合蛋白也可以在体外使用例如以在细胞培养或组织测定中降解特定的膜蛋白并且由此降低其水平并敲低其关联的信号传导。例如，在造血细胞中表达某些e3泛素连接酶诸如rnf130、rnf149和rnf167，并且在一些实施方案中，可以使用靶向这些连接酶的多特异性结合蛋白来在体内或在体外靶向造血细胞。类似地，在睾丸细胞中表达e3泛素连接酶诸如rnf133和rnf148，并且在一些实施方案中，可以使用靶向这些连接酶的多特异性结合蛋白来在体内或在体外靶向睾丸细胞。

3、本发明尤其提供了与至少第一细胞表面靶蛋白和第二细胞表面蛋白结合的多特异性结合蛋白，其中所述第一细胞表面靶蛋白为跨膜e3泛素连接酶。在一些方面，与在多特异性结合蛋白不存在的情况下观察到的水平相比，所述多特异性结合蛋白降低细胞的表面上所述第二细胞表面蛋白的水平。在某些方面，与在多特异性结合蛋白不存在的情况下观察到的水平相比，所述多特异性结合蛋白在体外降低细胞的表面上所述第二细胞表面蛋白的水平。在一些此类情况下，所述多特异性结合蛋白在体外降低细胞的表面上所述第二细胞表面蛋白的水平，如通过流式细胞术或通过发光测定所确定的。在一些情况下，与在多特异性结合蛋白不存在的情况下观察到的水平相比，所述多特异性结合蛋白在体内或者在体外且在体内均降低细胞的表面上所述第二细胞表面蛋白的水平。

4、在一些方面，本文的多特异性结合蛋白为多特异性抗体。例如，在一些方面，所述蛋白为双特异性或三特异性抗体，诸如1+1fabigg、1+1fvigg、2+1fvigg、2+1fabigg、单臂fvigg或单臂fabigg。在一些此类情况下，蛋白包含igg fc区，所述igg fc区包含至少一种杵臼修饰。

5、在一些方面，所述跨膜e3泛素连接酶不具有催化活性，其中催化活性的缺乏是在细胞表面降解测定中确定的。在其他方面，所述跨膜e3泛素连接酶具有催化活性，其中催化活性的存在是在细胞表面降解测定中确定的。

6、在一些方面，本文的多特异性结合蛋白与选自以下各项的跨膜e3泛素连接酶结合：rnf43、znrf3、rnf13、rnf128、rnf130、rnf133、rnf148、rnf149、rnf150、rnf167、znrf4、rspry1、syvn1、lnx1同种型2和trim7同种型3。在一些方面，本文的多特异性结合蛋白与选自以下各项的跨膜e3泛素连接酶结合：rnf43、rnf128、rnf130rnf133、rnf149、rnf150或znrf3。在一些方面，所述跨膜e3泛素连接酶为rnf130、rnf133、rnf149或rnf150。在一些方面，所述跨膜e3泛素连接酶为rnf130、rnf149或rnf167。在一些方面，所述跨膜e3泛素连接酶为rnf133或rnf148。在一些方面，所述跨膜e3泛素连接酶为rnf43或znfr3或两者，使得所述蛋白与rnf43、znrf3或rnf43和znrf3两者结合，任选地其中所述蛋白不阻断rnf43和/或znrf3与fzd和/或lrp6之间的结合。

7、在一些方面，所述多特异性结合蛋白为多特异性抗体，所述多特异性抗体与rnf43或znrf3结合；或包含与rnf43或znrf3结合的抗体重链可变区(vh)和轻链可变结构域(vl)，所述vh包含(a)cdr-h1、(b)cdr-h2和(c)cdr-h3，所述vl包含(d)cdr-l1、(e)cdr-l2和(f)cdr-l3；或包含与rnf43或znrf3结合的vh和vl。

8、在一些方面，所述多特异性结合蛋白包含以下抗体中的任一抗体的重链可变结构域(vh)，所述vh包含重链互补决定区1(cdr-h1)、cdr-h2和/或cdr-h3：rnf43-104、rnf43-106、rnf43-107、rnf43-108、rnf43-116、rnf43-117、rnf43-123、rnf43-126、rnf43-128、rnf43-129、rnf43-130、rnf43-136、rnf43-145、rnf43-152、rnf43-156、rnf43-168、rnf43-170、rnf43-176、rnf43-177、rnf43-179、rnf43-180、rnf43-181、rnf43-186、rnf43-187、rnf43-196、rnf43-200、rnf43-201、rnf43-206、rnf43-210、rnf43-213、rnf43-217、rnf43-221、rnf43-224、rnf43-25、rnf43-31、rnf43-33、rnf43-35、rnf43-38、rnf43-41、rnf43-53、rnf43-56、rnf43-61、rnf43-67、rnf43-69、rnf43-71、rnf43-74、rnf43-75、rnf43-76、rnf43-80、rnf43-86、rnf43-90、znrf3-101、znrf3-117、znrf3-128、znrf3-131、znrf3-163、znrf3-17、znrf3-170、znrf3-171、znrf3-172、znrf3-179、znrf3-182、znrf3-195、znrf3-219、znrf3-222、znrf3-223、znrf3-231、znrf3-237、znrf3-244、znrf3-247、znrf3-253、znrf3-254、znrf3-255、znrf3-265、znrf3-269、znrf3-270、znrf3-275、znrf3-279、znrf3-287、znrf3-296、znrf3-30、znrf3-300、znrf3-301、znrf3-305、znrf3-312、znrf3-314、znrf3-322、znrf3-329、znrf3-35、znrf3-55、znrf3-6、znrf3-90、rnf43-1、rnf43-24、rnf43-8、rnf43-12、rnf43-20、rnf43-11、rnf43-23、rnf43-6、rnf43-5、rnf43-15、rnf43-2、rnf43-16、rnf43-14、rnf43-17、rnf43-22、rnf43-9、rnf43-21、rnf43-13、rnf43-19、znrf3-331、znrf3-333或znrf3-332。

9、在一些方面，所述多特异性结合蛋白包含以下抗体中的任一抗体的重链可变区(vh)，所述vh包含所述cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3：rnf43-104、rnf43-106、rnf43-107、rnf43-108、rnf43-116、rnf43-117、rnf43-123、rnf43-126、rnf43-128、rnf43-129、rnf43-130、rnf43-136、rnf43-145、rnf43-152、rnf43-156、rnf43-168、rnf43-170、rnf43-176、rnf43-177、rnf43-179、rnf43-180、rnf43-181、rnf43-186、rnf43-187、rnf43-196、rnf43-200、rnf43-201、rnf43-206、rnf43-210、rnf43-213、rnf43-217、rnf43-221、rnf43-224、rnf43-25、rnf43-31、rnf43-33、rnf43-35、rnf43-38、rnf43-41、rnf43-53、rnf43-56、rnf43-61、rnf43-67、rnf43-69、rnf43-71、rnf43-74、rnf43-75、rnf43-76、rnf43-80、rnf43-86、rnf43-90、znrf3-101、znrf3-117、znrf3-128、znrf3-131、znrf3-163、znrf3-17、znrf3-170、znrf3-171、znrf3-172、znrf3-179、znrf3-182、znrf3-195、znrf3-219、znrf3-222、znrf3-223、znrf3-231、znrf3-237、znrf3-244、znrf3-247、znrf3-253、znrf3-254、znrf3-255、znrf3-265、znrf3-269、znrf3-270、znrf3-275、znrf3-279、znrf3-287、znrf3-296、znrf3-30、znrf3-300、znrf3-301、znrf3-305、znrf3-312、znrf3-314、znrf3-322、znrf3-329、znrf3-35、znrf3-55、znrf3-6、znrf3-90、rnf43-1、rnf43-24、rnf43-8、rnf43-12、rnf43-20、rnf43-11、rnf43-23、rnf43-6、rnf43-5、rnf43-15、rnf43-2、rnf43-16、rnf43-14、rnf43-17、rnf43-22、rnf43-9、rnf43-21、rnf43-13、rnf43-19、znrf3-331、znrf3-333或znrf3-332。

10、在一些方面，所述多特异性结合蛋白包含以下抗体中的任一抗体的轻链可变结构域(vl)，所述vl包含轻链互补决定区1(cdr-l1)、cdr-l2和/或cdr-l3：rnf43-104、rnf43-106、rnf43-107、rnf43-108、rnf43-116、rnf43-117、rnf43-123、rnf43-126、rnf43-128、rnf43-129、rnf43-130、rnf43-136、rnf43-145、rnf43-152、rnf43-156、rnf43-168、rnf43-170、rnf43-176、rnf43-177、rnf43-179、rnf43-180、rnf43-181、rnf43-186、rnf43-187、rnf43-196、rnf43-200、rnf43-201、rnf43-206、rnf43-210、rnf43-213、rnf43-217、rnf43-221、rnf43-224、rnf43-25、rnf43-31、rnf43-33、rnf43-35、rnf43-38、rnf43-41、rnf43-53、rnf43-56、rnf43-61、rnf43-67、rnf43-69、rnf43-71、rnf43-74、rnf43-75、rnf43-76、rnf43-80、rnf43-86、rnf43-90、znrf3-101、znrf3-117、znrf3-128、znrf3-131、znrf3-163、znrf3-17、znrf3-170、znrf3-171、znrf3-172、znrf3-179、znrf3-182、znrf3-195、znrf3-219、znrf3-222、znrf3-223、znrf3-231、znrf3-237、znrf3-244、znrf3-247、znrf3-253、znrf3-254、znrf3-255、znrf3-265、znrf3-269、znrf3-270、znrf3-275、znrf3-279、znrf3-287、znrf3-296、znrf3-30、znrf3-300、znrf3-301、znrf3-305、znrf3-312、znrf3-314、znrf3-322、znrf3-329、znrf3-35、znrf3-55、znrf3-6、znrf3-90、rnf43-1、rnf43-24、rnf43-8、rnf43-12、rnf43-20、rnf43-11、rnf43-23、rnf43-6、rnf43-5、rnf43-15、rnf43-2、rnf43-16、rnf43-14、rnf43-17、rnf43-22、rnf43-9、rnf43-21、rnf43-13、rnf43-19、znrf3-331、znrf3-333或znrf3-332。

11、在一些方面，所述多特异性结合蛋白包含以下抗体中的任一抗体的轻链可变区(vl)，所述vl包含所述cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3：rnf43-104、rnf43-106、rnf43-107、rnf43-108、rnf43-116、rnf43-117、rnf43-123、rnf43-126、rnf43-128、rnf43-129、rnf43-130、rnf43-136、rnf43-145、rnf43-152、rnf43-156、rnf43-168、rnf43-170、rnf43-176、rnf43-177、rnf43-179、rnf43-180、rnf43-181、rnf43-186、rnf43-187、rnf43-196、rnf43-200、rnf43-201、rnf43-206、rnf43-210、rnf43-213、rnf43-217、rnf43-221、rnf43-224、rnf43-25、rnf43-31、rnf43-33、rnf43-35、rnf43-38、rnf43-41、rnf43-53、rnf43-56、rnf43-61、rnf43-67、rnf43-69、rnf43-71、rnf43-74、rnf43-75、rnf43-76、rnf43-80、rnf43-86、rnf43-90、znrf3-101、znrf3-117、znrf3-128、znrf3-131、znrf3-163、znrf3-17、znrf3-170、znrf3-171、znrf3-172、znrf3-179、znrf3-182、znrf3-195、znrf3-219、znrf3-222、znrf3-223、znrf3-231、znrf3-237、znrf3-244、znrf3-247、znrf3-253、znrf3-254、znrf3-255、znrf3-265、znrf3-269、znrf3-270、znrf3-275、znrf3-279、znrf3-287、znrf3-296、znrf3-30、znrf3-300、znrf3-301、znrf3-305、znrf3-312、znrf3-314、znrf3-322、znrf3-329、znrf3-35、znrf3-55、znrf3-6、znrf3-90、rnf43-1、rnf43-24、rnf43-8、rnf43-12、rnf43-20、rnf43-11、rnf43-23、rnf43-6、rnf43-5、rnf43-15、rnf43-2、rnf43-16、rnf43-14、rnf43-17、rnf43-22、rnf43-9、rnf43-21、rnf43-13、rnf43-19、znrf3-331、znrf3-333或znrf3-332。

12、在一些方面，所述多特异性结合蛋白包含以下抗体中的任一抗体的重链可变结构域(vh)和(b)轻链可变结构域(vl)，所述vh包含(a)重链互补决定区1(cdr-h1)、cdr-h2和cdr-h3，所述vl包含(a)轻链互补决定区1(cdr-l1)、cdr-l2和cdr-l3：rnf43-104、rnf43-106、rnf43-107、rnf43-108、rnf43-116、rnf43-117、rnf43-123、rnf43-126、rnf43-128、rnf43-129、rnf43-130、rnf43-136、rnf43-145、rnf43-152、rnf43-156、rnf43-168、rnf43-170、rnf43-176、rnf43-177、rnf43-179、rnf43-180、rnf43-181、rnf43-186、rnf43-187、rnf43-196、rnf43-200、rnf43-201、rnf43-206、rnf43-210、rnf43-213、rnf43-217、rnf43-221、rnf43-224、rnf43-25、rnf43-31、rnf43-33、rnf43-35、rnf43-38、rnf43-41、rnf43-53、rnf43-56、rnf43-61、rnf43-67、rnf43-69、rnf43-71、rnf43-74、rnf43-75、rnf43-76、rnf43-80、rnf43-86、rnf43-90、znrf3-101、znrf3-117、znrf3-128、znrf3-131、znrf3-163、znrf3-17、znrf3-170、znrf3-171、znrf3-172、znrf3-179、znrf3-182、znrf3-195、znrf3-219、znrf3-222、znrf3-223、znrf3-231、znrf3-237、znrf3-244、znrf3-247、znrf3-253、znrf3-254、znrf3-255、znrf3-265、znrf3-269、znrf3-270、znrf3-275、znrf3-279、znrf3-287、znrf3-296、znrf3-30、znrf3-300、znrf3-301、znrf3-305、znrf3-312、znrf3-314、znrf3-322、znrf3-329、znrf3-35、znrf3-55、znrf3-6、znrf3-90、rnf43-1、rnf43-24、rnf43-8、rnf43-12、rnf43-20、rnf43-11、rnf43-23、rnf43-6、rnf43-5、rnf43-15、rnf43-2、rnf43-16、rnf43-14、rnf43-17、rnf43-22、rnf43-9、rnf43-21、rnf43-13、rnf43-19、znrf3-331、znrf3-333或znrf3-332。

13、在以上情况中的任一情况下，重链cdr和/或轻链cdr可以为kabat、chothia或mccallum cdr。上文中所列的抗体的关联的vh和vl氨基酸和dna序列以seq id no:33-444提供在下文的序列表中。

14、在一些方面，所述多特异性结合蛋白包含重链可变区(vh)，所述vh包含与以下抗体中的任一抗体的所述vh至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列：rnf43-104、rnf43-106、rnf43-107、rnf43-108、rnf43-116、rnf43-117、rnf43-123、rnf43-126、rnf43-128、rnf43-129、rnf43-130、rnf43-136、rnf43-145、rnf43-152、rnf43-156、rnf43-168、rnf43-170、rnf43-176、rnf43-177、rnf43-179、rnf43-180、rnf43-181、rnf43-186、rnf43-187、rnf43-196、rnf43-200、rnf43-201、rnf43-206、rnf43-210、rnf43-213、rnf43-217、rnf43-221、rnf43-224、rnf43-25、rnf43-31、rnf43-33、rnf43-35、rnf43-38、rnf43-41、rnf43-53、rnf43-56、rnf43-61、rnf43-67、rnf43-69、rnf43-71、rnf43-74、rnf43-75、rnf43-76、rnf43-80、rnf43-86、rnf43-90、znrf3-101、znrf3-117、znrf3-128、znrf3-131、znrf3-163、znrf3-17、znrf3-170、znrf3-171、znrf3-172、znrf3-179、znrf3-182、znrf3-195、znrf3-219、znrf3-222、znrf3-223、znrf3-231、znrf3-237、znrf3-244、znrf3-247、znrf3-253、znrf3-254、znrf3-255、znrf3-265、znrf3-269、znrf3-270、znrf3-275、znrf3-279、znrf3-287、znrf3-296、znrf3-30、znrf3-300、znrf3-301、znrf3-305、znrf3-312、znrf3-314、znrf3-322、znrf3-329、znrf3-35、znrf3-55、znrf3-6、znrf3-90、rnf43-1、rnf43-24、rnf43-8、rnf43-12、rnf43-20、rnf43-11、rnf43-23、rnf43-6、rnf43-5、rnf43-15、rnf43-2、rnf43-16、rnf43-14、rnf43-17、rnf43-22、rnf43-9、rnf43-21、rnf43-13、rnf43-19、znrf3-331、znrf3-333或znrf3-332，任选地其中所述vh的cdr-h1、cdr-h2和/或cdr-h3的所述氨基酸序列与所选抗体的氨基酸序列100％相同。

15、在一些方面，所述多特异性结合蛋白包含轻链可变区(vl)，所述vl包含与以下抗体中的任一抗体的所述vl至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列：rnf43-104、rnf43-106、rnf43-107、rnf43-108、rnf43-116、rnf43-117、rnf43-123、rnf43-126、rnf43-128、rnf43-129、rnf43-130、rnf43-136、rnf43-145、rnf43-152、rnf43-156、rnf43-168、rnf43-170、rnf43-176、rnf43-177、rnf43-179、rnf43-180、rnf43-181、rnf43-186、rnf43-187、rnf43-196、rnf43-200、rnf43-201、rnf43-206、rnf43-210、rnf43-213、rnf43-217、rnf43-221、rnf43-224、rnf43-25、rnf43-31、rnf43-33、rnf43-35、rnf43-38、rnf43-41、rnf43-53、rnf43-56、rnf43-61、rnf43-67、rnf43-69、rnf43-71、rnf43-74、rnf43-75、rnf43-76、rnf43-80、rnf43-86、rnf43-90、znrf3-101、znrf3-117、znrf3-128、znrf3-131、znrf3-163、znrf3-17、znrf3-170、znrf3-171、znrf3-172、znrf3-179、znrf3-182、znrf3-195、znrf3-219、znrf3-222、znrf3-223、znrf3-231、znrf3-237、znrf3-244、znrf3-247、znrf3-253、znrf3-254、znrf3-255、znrf3-265、znrf3-269、znrf3-270、znrf3-275、znrf3-279、znrf3-287、znrf3-296、znrf3-30、znrf3-300、znrf3-301、znrf3-305、znrf3-312、znrf3-314、znrf3-322、znrf3-329、znrf3-35、znrf3-55、znrf3-6、znrf3-90、rnf43-1、rnf43-24、rnf43-8、rnf43-12、rnf43-20、rnf43-11、rnf43-23、rnf43-6、rnf43-5、rnf43-15、rnf43-2、rnf43-16、rnf43-14、rnf43-17、rnf43-22、rnf43-9、rnf43-21、rnf43-13、rnf43-19、znrf3-331、znrf3-333或znrf3-332，任选地其中所述vh的cdr-h1、cdr-h2和/或cdr-h3的所述氨基酸序列与所选抗体的氨基酸序列100％相同。

16、在一些方面，所述多特异性结合蛋白包含重链可变区(vh)，所述vh包含以下抗体中的任一抗体的所述vh的氨基酸序列：rnf43-104、rnf43-106、rnf43-107、rnf43-108、rnf43-116、rnf43-117、rnf43-123、rnf43-126、rnf43-128、rnf43-129、rnf43-130、rnf43-136、rnf43-145、rnf43-152、rnf43-156、rnf43-168、rnf43-170、rnf43-176、rnf43-177、rnf43-179、rnf43-180、rnf43-181、rnf43-186、rnf43-187、rnf43-196、rnf43-200、rnf43-201、rnf43-206、rnf43-210、rnf43-213、rnf43-217、rnf43-221、rnf43-224、rnf43-25、rnf43-31、rnf43-33、rnf43-35、rnf43-38、rnf43-41、rnf43-53、rnf43-56、rnf43-61、rnf43-67、rnf43-69、rnf43-71、rnf43-74、rnf43-75、rnf43-76、rnf43-80、rnf43-86、rnf43-90、znrf3-101、znrf3-117、znrf3-128、znrf3-131、znrf3-163、znrf3-17、znrf3-170、znrf3-171、znrf3-172、znrf3-179、znrf3-182、znrf3-195、znrf3-219、znrf3-222、znrf3-223、znrf3-231、znrf3-237、znrf3-244、znrf3-247、znrf3-253、znrf3-254、znrf3-255、znrf3-265、znrf3-269、znrf3-270、znrf3-275、znrf3-279、znrf3-287、znrf3-296、znrf3-30、znrf3-300、znrf3-301、znrf3-305、znrf3-312、znrf3-314、znrf3-322、znrf3-329、znrf3-35、znrf3-55、znrf3-6、znrf3-90、rnf43-1、rnf43-24、rnf43-8、rnf43-12、rnf43-20、rnf43-11、rnf43-23、rnf43-6、rnf43-5、rnf43-15、rnf43-2、rnf43-16、rnf43-14、rnf43-17、rnf43-22、rnf43-9、rnf43-21、rnf43-13、rnf43-19、znrf3-331、znrf3-333或znrf3-332。

17、在一些方面，所述多特异性结合蛋白包含轻链可变区(vl)，所述vl包含以下抗体中的任一抗体的所述vl的氨基酸序列：rnf43-104、rnf43-106、rnf43-107、rnf43-108、rnf43-116、rnf43-117、rnf43-123、rnf43-126、rnf43-128、rnf43-129、rnf43-130、rnf43-136、rnf43-145、rnf43-152、rnf43-156、rnf43-168、rnf43-170、rnf43-176、rnf43-177、rnf43-179、rnf43-180、rnf43-181、rnf43-186、rnf43-187、rnf43-196、rnf43-200、rnf43-201、rnf43-206、rnf43-210、rnf43-213、rnf43-217、rnf43-221、rnf43-224、rnf43-25、rnf43-31、rnf43-33、rnf43-35、rnf43-38、rnf43-41、rnf43-53、rnf43-56、rnf43-61、rnf43-67、rnf43-69、rnf43-71、rnf43-74、rnf43-75、rnf43-76、rnf43-80、rnf43-86、rnf43-90、znrf3-101、znrf3-117、znrf3-128、znrf3-131、znrf3-163、znrf3-17、znrf3-170、znrf3-171、znrf3-172、znrf3-179、znrf3-182、znrf3-195、znrf3-219、znrf3-222、znrf3-223、znrf3-231、znrf3-237、znrf3-244、znrf3-247、znrf3-253、znrf3-254、znrf3-255、znrf3-265、znrf3-269、znrf3-270、znrf3-275、znrf3-279、znrf3-287、znrf3-296、znrf3-30、znrf3-300、znrf3-301、znrf3-305、znrf3-312、znrf3-314、znrf3-322、znrf3-329、znrf3-35、znrf3-55、znrf3-6、znrf3-90、rnf43-1、rnf43-24、rnf43-8、rnf43-12、rnf43-20、rnf43-11、rnf43-23、rnf43-6、rnf43-5、rnf43-15、rnf43-2、rnf43-16、rnf43-14、rnf43-17、rnf43-22、rnf43-9、rnf43-21、rnf43-13、rnf43-19、znrf3-331、znrf3-333或znrf3-332。如上所述，上文列出的抗体的vh和vl氨基酸和dna序列在下文的序列表中的seqid no:33-444中。

18、在一些方面，所述多特异性结合蛋白与znrf3和/或rnf43结合，并且对znrf3或rnf43具有小于50nm、或小于10nm、或小于1nm、或小于0.5nm、或小于0.05nm、或介于50nm与10nm之间、或介于10nm与1nm之间、或介于1nm与0.5nm之间、或介于0.5nm与0.05nm之间、或介于0.05nm与0.01nm之间的结合亲和力。在一些方面，所述蛋白为包含大鼠抗人rnf43 b细胞抗体、大鼠抗人znrf3 b细胞抗体、兔抗人rnf43 b细胞抗体或兔抗人znrf3 b细胞抗体的重链可变区和/或轻链可变区的多特异性抗体。在一些方面，所述蛋白为包含2+1fvigg或2+1fabigg形式的三特异性抗体，其中所述蛋白与znrf3和rnf43两者并且与至少一种第二细胞表面蛋白结合，任选地其中所述蛋白不阻断znrf3或rnf43与fzd和lrp6的结合。

19、在一些方面，本文的多特异性结合蛋白可以是包含嵌合的重链可变区或轻链可变区或包含人源化可变区的多特异性抗体。在一些情况下，所述蛋白包含野生型人fc区。在一些情况下，所述fc区为igg1、igg2、igg3或igg4 fc区、任选地野生型人fc区或具有一个或多个工程化突变的人fc区。在一些情况下，所述蛋白包含具有效应子功能的fc区。在一些情况下，所述蛋白包含人igg1 fc区，所述人igg1 fc区包含lalapg突变或在n297位的取代诸如n297g或n297q，且/或其中所述fc区缺乏效应子功能。

20、在一些方面，所述多特异性结合蛋白所结合的所述第二细胞表面蛋白为受体酪氨酸激酶、生长因子受体、细胞因子、粘蛋白、siglec受体或免疫检查点调节剂，或者为her2、her3、igf1r、egfr、fgfr、vegfr、pdgfr、epcam、fzd、pd-l1、ctla4、pd-1、tim3、lag3、tigit、ceacam1、cd25、ilt-2、ilt-3、ilt-4、ilt-5、lair-1、pecam-1(cd31)、pilr-α、sirl-1或sirp-α。在一些情况下，所述第二细胞表面蛋白为her2、egfr或igf1r。在一些情况下，所述多特异性结合蛋白包含抗her2抗体诸如4d5、7c2或2c4或者抗igf1r抗体诸如西妥木单抗(cixutumumab)、加尼妥单抗(ganitumab)、达洛珠单抗(dalotuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、罗妥木单抗(robatumumab)、替妥木单抗(teprotumumab)或艾司妥单抗(istiratumab)的重链可变区和轻链可变区。

21、本公开还涉及分离的核酸或核酸组(例如，包含两个或更多个核酸，每个核酸编码多聚体蛋白质的一部分诸如轻链或重链或半抗体)，其编码如本文所述的多特异性结合蛋白。本公开还涉及宿主细胞，其包含此类核酸或核酸组。本公开还涵盖生产本文的多特异性结合蛋白的方法，所述方法包括在适于表达所述蛋白的条件下培养包含编码所述蛋白的核酸或核酸组的宿主细胞。这种方法可以进一步包括从所述宿主细胞回收所述蛋白。本公开进一步涵盖通过本文的方法生产的多特异性结合蛋白。

22、还可以制备一种药物组合物，其包含如本文所述的多特异性结合蛋白以及药用载体。

23、本公开还涵盖多特异性结合蛋白和相关的药物组合物，其用作药物，例如用于治疗受试者的癌症、自身免疫病症、炎性病症、神经退行性病症或传染病，和/或用于降低有此需要的受试者的细胞表面蛋白的水平，任选地其中所述受试者患有癌症、自身免疫病症、炎性病症、神经退行性病症或传染病，和/或用于增加受试者诸如患有癌症、自身免疫病症、炎性病症、神经退行性病症或传染病的受试者的免疫应答。在一些方面，(a)所述受试者具有rnf43中的突变并且所述多特异性结合蛋白不与rnf43结合或不活化rnf43，或者(b)所述受试者具有znrf3中的突变并且所述多特异性结合蛋白不与znrf3结合或不活化znrf3。在一些此类情况下，当所述受试者具有rnf43或znrf3突变时，所述受试者患有癌症，其中所述癌症包含所述突变。

24、本公开还涉及本文的多特异性结合蛋白或药物组合物在制造用于治疗受试者的癌症、自身免疫病症、炎性病症、神经退行性病症或传染病；和/或用于降低有此需要的受试者的细胞表面蛋白的水平，任选地其中所述受试者患有癌症、自身免疫病症、炎性病症、神经退行性病症或传染病；和/或用于增加受试者诸如患有癌症、自身免疫病症、炎性病症、神经退行性病症或传染病的受试者的免疫应答的药物中的用途。在一些方面，(a)所述受试者具有rnf43中的突变并且所述多特异性结合蛋白不与rnf43结合或不活化rnf43，或者(b)所述受试者具有znrf3中的突变并且所述多特异性结合蛋白不与znrf3结合或不活化znrf3。在一些此类情况下，当所述受试者具有rnf43或znrf3突变时，所述受试者患有癌症，其中所述癌症包含所述突变。

25、本公开还涉及治疗有此需要的受试者的癌症、自身免疫病症、炎性病症、神经退行性病症或传染病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文的多特异性结合蛋白或药物组合物。本公开进一步涉及降低有此需要的受试者的细胞表面蛋白的水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文的多特异性结合蛋白或药物组合物，任选地其中所述受试者患有癌症、自身免疫病症、炎性病症、神经退行性病症或传染病。本公开进一步涉及增加有此需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文的多特异性结合蛋白或药物组合物，任选地其中所述受试者患有癌症、自身免疫病症、炎性病症、神经退行性病症或传染病。在一些方面，(a)所述受试者具有rnf43中的突变并且所述多特异性结合蛋白不与rnf43结合或不活化rnf43，或者(b)所述受试者具有znrf3中的突变并且所述多特异性结合蛋白不与znrf3结合或不活化znrf3。在一些此类情况下，当所述受试者具有rnf43或znrf3突变时，所述受试者患有癌症，其中所述癌症包含所述突变。在一些情况下，所述方法进一步包括，在施用所述多特异性结合蛋白之前，确定所述受试者是否具有rnf43或znrf3中的突变，其中(a)如果所述受试者具有rnf43中的突变，则所述多特异性结合蛋白不与rnf43结合或不活化rnf43，以及(b)如果所述受试者具有znrf3中的突变，则所述多特异性结合蛋白不与znrf3结合或不活化znrf3。

26、在一些方面，本文的多特异性结合蛋白可以用于通过靶向主要表达在特定细胞类型上的e3泛素连接酶来耗尽那些细胞类型上的细胞表面蛋白的水平。例如，本公开还包括使用本文的多特异性结合蛋白诱导造血细胞的表面上的细胞表面蛋白的降解的方法，其中多特异性蛋白中使用的跨膜e3泛素连接酶为rnf130、rnf149或rnf167。附加地，本公开还包括使用本文的多特异性结合蛋白诱导睾丸细胞的表面上的细胞表面蛋白的降解的方法，其中多特异性蛋白中使用的跨膜e3泛素连接酶为rnf133或rnf148。在某些方面，与在所述多特异性结合蛋白不存在的情况下观察到的水平相比，所述多特异性结合蛋白在体外降低特定细胞类型诸如造血细胞或睾丸细胞的表面上所述细胞表面蛋白的水平。在一些此类情况下，所述多特异性结合蛋白在体内降低特定细胞类型诸如造血细胞或睾丸细胞的表面上所述细胞表面蛋白的水平，如通过流式细胞术或通过发光测定所确定的。在一些情况下，与在多特异性结合蛋白不存在的情况下观察到的水平相比，所述多特异性结合蛋白在体内或者在体外且在体内均降低特定细胞类型诸如这些的表面上所述第二细胞表面蛋白的水平。因此，本公开还包括在受试者体外或体内降低细胞或组织样品中造血细胞的表面上的细胞表面蛋白的水平的方法，所述方法包括向所述细胞或组织样品或向所述受试者施用靶向rnf130、rnf149和rnf167中的一个或多个的多特异性结合蛋白。本公开还包括在受试者体外或体内降低细胞或组织样品中睾丸细胞的表面上的细胞表面蛋白的水平的方法，所述方法包括向所述细胞或组织样品或向所述受试者施用靶向rnf133和rnf148中的一者或两者的多特异性结合蛋白。

27、本公开还涵盖试剂盒，其包含本文所述的多特异性结合蛋白、核酸、核酸组或宿主细胞，并且进一步包含用于表达或纯化所述多特异性结合蛋白的一种或多种试剂和/或用于将所述蛋白与细胞或组织样品在体外孵育以降低所述样品中细胞表面蛋白的水平的一种或多种试剂。此外，本公开还涵盖在体外降低细胞或组织样品中细胞表面蛋白的水平的方法，所述方法包括将所述样品用本文所述的多特异性结合蛋白孵育。