抗CD25抗体、其抗原结合片段及其医药用途的制作方法

本公开属于生物医药领域，特别是癌症免疫治疗领域，包括治疗癌症(例如实体瘤)的方法，涉及抗cd25抗体或其抗原结合片段的使用。

背景技术：

1、肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗领域的热点，目前主要通过提高肿瘤内部cd4+和cd8+t细胞或者抑制肿瘤内部抑制型免疫细胞的数目和活性，例如，抑制调节性t细胞(treg)、骨髓来源的抑制性细胞mdsc或肿瘤相关巨噬细胞。通过降低或消除肿瘤内部treg细胞的治疗策略已经得到临床验证。

2、cd25是由272个氨基酸组成的i型膜蛋白，其在t细胞上的表达受tcr信号的调控，因此常作为t细胞激活的标志。il-2具有免疫激活作用，是肿瘤治疗的免疫调节剂，其通过细胞表面的il-2受体(il-2r)发生作用。il-2r包括三个亚基，il-2rα(即cd25)、il-2rβ(即cd122)和il-2rγ(即cd132)。三个亚基可以形成三种受体形式：高结合力受体包含所有三个亚基il-2rα/β/γ，中结合力受体包含il-2rβ/γ，低结合力受体为il-2rα。il-2rα(即cd25)单独与il-2的亲和力较低(kd为10-8m)，并且不传导细胞内信号。il-2rβ和il-2rγ是il-2激活下游信号通路所必需的，当il-2同时结合il-2rβ和il-2rγ时，两个受体亚基形成异源二聚体。当il-2rα(即cd25)与il-2rβ和il-2rγ形成高亲和力受体(kd为10-11m)时，能激活下游jak-stat，pi3k-akt和mapk信号通路，从而促进t细胞、nk细胞等淋巴细胞的增殖与活性。

3、部分已有的抗cd25抗体阻断或抑制il-2与cd25结合，例如参见wo2004/045512、wo2006/108670、wo1993/011238、wo1990/007861和wo2017/174331。巴利昔单抗(basiliximab)和达利珠单抗(daclizumab，dac)均是抑制il-2与cd25结合的igg1型抗人cd25抗体，基于cd25介导il-2的免疫激活功能，均被开发用于减少效应t细胞(teff)的活化。巴利昔单抗是目前被批准用于移植物抗宿主疾病(gvhd)的嵌和型抗cd25抗体，而达利珠单抗是被批准用于治疗多发性硬化症的人源化抗cd25抗体。

4、由于cd25在treg上的表达丰度远高于其它免疫细胞，因此cd25也可以作为treg特异性标记物用于开发抗体，通过抗体介导的细胞毒作用(adcc)和抗体介导的细胞吞噬作用(adcp)来去除肿瘤内部的treg细胞，解除treg对于肿瘤内部t细胞的抑制，从而促进抗肿瘤免疫。但cd25同时也介导il-2对效应t细胞的激活，如果cd25抗体抑制了il-2信号通路，将会抑制teff，拮抗其抗肿瘤活性。一些文献提到抗cd25单独或组合用于癌症或与treg消耗有关的用途(wo 2004/074437、wo 2006/108670、wo 2006/050172、wo 2011/077245、wo2016/021720、wo 2004/045512)，因此需要允许il-2与cd25结合的抗cd25抗体。临床前研发的cd25抗体包括7d4(大鼠抗小鼠cd25，例如参见malek et al.pnas，1983sep；80(18):5694-8；onizuka s et al.,cancer res.1999jul 1；59(13):3128-33)、7g7b6(抗人cd25，例如参见zhang et al.，cancer biother radiopharm.2009jun；24(3):303-309)、pc61(大鼠抗小鼠cd25，例如参见yulius y setiady et al.，eur j immunol.2010mar；40(3):780-6)，在小鼠癌症模型中进行测试时，pc61由于其对cd25和il2结合抑制作用，未能显示出抗肿瘤活性，而7d4由于其不影响il2对cd25的结合，显示出优于pc61的抗肿瘤活性。此外，wo2019/175216中提供了罗氏公司和tusk公司联合开发的靶向cd25的抗体rg6292，已经进入临床i期，以检测其在实体瘤中的安全性及药效。wo2018167104中也提供了不影响il-2与cd25结合的抗cd25抗体。

5、开发抑制肿瘤效果更优的、安全性更高的、不抑制il-2与cd25的结合的、能够通过adcc和adcp效应消除treg，同时避免抑制teff活性的抗cd25抗体仍然是本领域亟需的。

技术实现思路

1、本公开提供抗cd25抗体、其抗原结合片段，及其编码核酸、载体、宿主细胞、药物组合物、用于治疗癌症(特别是实体瘤)的方法和制药用途。

2、抗cd25抗体、其抗原结合片段

3、本公开提供抗cd25抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区(vh)和/或轻链可变区(vl)，其中：

4、1)所述vh含有seq id no:1中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:2中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

5、2)所述vh含有seq id no：3中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:4中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

6、3)所述vh含有seq id no:5中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:6中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

7、4)所述vh含有seq id no:7中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:8中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

8、5)所述vh含有seq id no:9中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:10中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

9、6)所述vh含有seq id no:11中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:12中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

10、7)所述vh含有seq id no:13中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:14中的lcdr1、lcdr2、lcdr3；

11、8)所述vh含有seq id no:15中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:16中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

12、9)所述vh含有seq id no:17中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:18中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

13、10)所述vh含有seq id no:19中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:20中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

14、11)所述vh含有seq id no:21中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:22中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

15、12)所述vh含有seq id no:23中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:24中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

16、13)所述vh含有seq id no:25中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:26中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

17、14)所述vh含有seq id no:59中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:60中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

18、15)所述vh含有seq id no:59中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:63中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或

19、16)所述vh含有seq id no:59中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl含有seq id no:64中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

20、上述cdr是根据kabat、imgt、chothia、abm或contact编号系统定义的；一些具体实施方案中，cdr是根据kabat编号系统定义的。

21、一些实施方案中，包含如1)、2)、3)、5)或6)所示的vh和vl的抗体或其抗原结合片段阻断或部分阻断il-2与cd25的结合；另一些实施方案中，包含如4)、7)、8)、9)、10)、11)、12)、13)、14)、15)或16)所示的vh和vl的抗体或其抗原结合片段不阻断、不抑制或几乎不阻断、不抑制il-2与cd25的结合。

22、一些实施方案中，提供抗cd25抗体或其抗原结合片段，其包含vh和/或vl，其中：

23、所述vh包含选自seq id no：27、33、39或45的hcdr1，和/或选自seq id no：28、34、40或46的hcdr2，和/或选自seq id no：29、35、41或47的hcdr3；所述vl包含选自seq id no：30、36、42、48、65或66的lcdr1，和/或选自seq id no：31、37、43或49的lcdr2，和/或选自seqid no：32、38、44或50的lcdr3。

24、一些实施方案中，提供抗cd25抗体或其抗原结合片段，包含vh和/或vl，其中：

25、i)所述vh包含如seq id no：27所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr1，如seq id no：28所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr2，和如seqid no：29所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr3；和/或所述vl包含如seqid no：30所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr1，如seq id no：31所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr2，和如seq id no：32所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr3；

26、ii)所述vh包含如seq id no：33所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr1，如seq id no：34所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr2，和如seqid no：35所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr3；和/或所述vl包含如seqid no：36所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr1，如seq id no：37所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr2，和如seq id no：38所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr3；

27、iii)所述vh包含如seq id no：39所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr1，如seq id no：40所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr2，和如seqid no：41所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr3；和/或所述vl包含如seqid no：42所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr1，如seq id no：43所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr2，和如seq id no：44所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr3；

28、iv)所述vh包含如seq id no：45所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr1，如seq id no：46所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr2，和如seqid no：47所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr3；和/或所述vl包含如seqid no：48所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr1，如seq id no：49所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr2，和如seq id no：50所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr3；

29、v)所述vh包含如seq id no：45所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr1，如seq id no：46所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr2，和如seqid no：47所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr3；和/或所述vl包含如seqid no：65所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr1，如seq id no：49所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr2，和如seq id no：50所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr3；或

30、vi)所述vh包含如seq id no：45所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr1，如seq id no：46所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr2，和如seqid no：47所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的hcdr3；和/或所述vl包含如seqid no：66所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr1，如seq id no：49所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr2，和如seq id no：50所示或与其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的lcdr3。

31、一些具体实施方案中，上述具有氨基酸突变的抗cd25抗体或其抗原结合片段与亲本抗体或抗原结合片段具有相同或基本相同的与人cd25结合的亲和力和\或功能(例如adcc、adcp、抗肿瘤活性)。

32、一些实施方案中，本公开的前述抗cd25抗体或其抗原结合片段以等于或小于10-7m解离平衡常数与人cd25结合。在一些实施方案中，以等于或小于10-8m、10-9m、10-10m或10-11m解离平衡常数与人cd25结合。

33、一些实施方案中，提供抗cd25抗体或其抗原结合片段，包含vh和/或vl，其中：

34、所述vh包含分别如seq id no：27、28和29所示的hcdr1、hcdr2的hcdr3，所述vl包含分别如seq id no：30、31和32所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

35、所述vh包含分别如seq id no：33、34和35所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含分别如seq id no：36、37和38所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

36、所述vh包含分别如seq id no：39、40和41所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含分别如seq id no：42、43和44所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

37、所述vh包含分别如seq id no：45、46和47所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含分别如seq id no：48、49和50所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

38、所述vh包含分别如seq id no：45、46和47所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含分别如seq id no：65、49和50所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；或

39、所述vh包含分别如seq id no：45、46和47所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述vl包含分别如seq id no：66、49和50所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3.

40、一些实施方案中，抗cd25抗体或其抗原结合片段包含vh和vl，其中：

41、所述vh如seq id no：1所示，所述vl如seq id no：2所示；

42、所述vh如seq id no：3所示，所述vl如seq id no：4所示；

43、所述vh如seq id no：5所示，所述vl如seq id no：6所示

44、所述vh如seq id no：7所示，所述vl如seq id no：8所示；

45、所述vh如seq id no：9所示，所述vl如seq id no：10所示；

46、所述vh如seq id no：11所示，所述vl如seq id no：12所示；

47、所述vh如seq id no：13所示，所述vl如seq id no：14所示；

48、所述vh如seq id no：15所示，所述vl如seq id no：16所示；或

49、所述vh如seq id no：17所示，所述vl如seq id no：18所示；所述抗体为鼠源抗体或其片段。

50、一些具体实施方案中，提供抗cd25抗体或其抗原结合片段变体，其包含vh和/或vl，所述vh和/或vl与前述抗cd25抗体或其抗原结合片段的vh和/或vl分别具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

51、一些实施方案中，抗cd25抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体或其片段，例如，为人源化抗体或其片段。

52、一些实施方案中，基于鼠源抗cd25抗体或其抗原结合片段制备嵌和抗体，进行人源化，后进行回复突变。此处全文引入us20030040606和us7494647中人源化的方法。

53、一些实施方案中，抗cd25抗体或其抗原结合片段包含vh和vl，其中：

54、所述vh包含选自ighv1-46*01的fr1至fr3、和选自ighj1*01的fr4，所述vl包含选自igkv4-1*01的fr1至fr3、和选自igkj4*01的fr4；

55、所述vh包含选自ighv1-18*01的fr1至fr2、选自ighv1-69*02的fr3、和选自highj6*01_14的fr4，所述vl包含选自igkv3-11*01的fr1、选自igkv5-2*01的fr2、选自igkv6-21*01的fr3、和选自higkj4*01_12的fr4；

56、所述vh包含选自ighv1-18*01的fr1、选自ighv4-31*01的fr2、选自ighv1-3*01的fr3、和选自highj6*01的fr4，所述vl包含选自igkv4-1*01的fr1至fr3、和选自higkj2*01的fr4；或

57、所述vh包含选自ighv3-23*04的fr1至fr3、和选自ighj1*01的fr4，所述vl包含选自igkv2-28*01的fr1至fr3、和选自igkj4*01的fr4。

58、一些具体实施方案中，抗cd25抗体或其抗原结合片段包含vh和/或vl，其中，

59、所述vh包含分别如seq id no：27、28和29所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3，和选自ighv1-46*01的fr1至fr3、和选自ighj1*01的fr4；所述vl包含分别如seq id no：30、31和32所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和选自igkv4-1*01的fr1至fr3、和选自igkj4*01的fr4；

60、所述vh包含分别如seq id no：33、34和35所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3，和选自ighv1-18*01的fr1至fr2、选自ighv1-69*02的fr3、和选自highj6*01_14的fr4；所述vl包含分别如seq id no：36、37和38所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和选自igkv3-11*01的fr1、选自igkv5-2*01的fr2、选自igkv6-21*01的fr3、和选自higkj4*01_12的fr4；

61、所述vh包含分别如seq id no：39、40和41所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3，和选自ighv1-18*01的fr1、选自ighv4-31*01的fr2、选自ighv1-3*01的fr3、和选自highj6*01的fr4；所述vl包含分别如seq id no：42、43和44所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和选自igkv4-1*01的fr1至fr3、和选自higkj2*01的fr4；

62、所述vh包含分别如seq id no：45、46和47所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3，和选自ighv3-23*04的fr1至fr3、和选自ighj1*01的fr4；所述vl包含分别如seq id no：48、49和50所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和选自igkv2-28*01的fr1至fr3、和选自igkj4*01的fr4；

63、所述vh包含分别如seq id no：45、46和47所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3，和选自ighv3-23*04的fr1至fr3、和选自ighj1*01的fr4；所述vl包含分别如seq id no：65、49和50所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和选自igkv2-28*01的fr1至fr3、和选自igkj4*01的fr4；或

64、所述vh包含分别如seq id no：45、46和47所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3，和选自ighv3-23*04的fr1至fr3、和选自ighj1*01的fr4；所述vl包含分别如seq id no：66、49和50所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和选自igkv2-28*01的fr1至fr3、和选自igkj4*01的fr4。可以对上述fr进行回复突变，以保持抗体活性。

65、一些实施方案中，抗cd25抗体或其抗原结合片段包含vh和/或vl，其中：

66、所述vh如seq id no：19所示，所述vl如seq id no：20所示；

67、所述vh如seq id no：21所示，所述vl如seq id no：22所示；

68、所述vh如seq id no：23所示，所述vl如seq id no：24所示；

69、所述vh如seq id no：25所示，所述vl如seq id no：26所示；

70、所述vh如seq id no：59所示，所述vl如seq id no：60所示；

71、所述vh如seq id no：59所示，所述vl如seq id no：63所示；或

72、所述vh如seq id no：59所示，所述vl如seq id no：64所示；所述抗体为人源化抗体或其片段。

73、一些具体实施方案中，提供抗cd25抗体或其抗原结合片段变体，其包含vh和/或vl，所述vh和/或vl与前述抗cd25抗体或其抗原结合片段的vh和/或vl分别具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

74、一些实施方案中，抗cd25抗体或其抗原结合片段进一步包含抗体的重链恒定区和/或轻链恒定区，例如人igg1、igg2、igg3和igg4的重链恒定区及其常规变体，所述抗体的轻链恒定区选自人抗体κ和λ链恒定区及其常规变体；又例如鼠的igg，例如鼠igg2a。

75、一些实施方案中，所述抗原结合片段选自fab、fab'、f(ab')2、单链抗体(scfv)、二聚化的v区(双抗体)、二硫键稳定化的v区(dsfv)和其他包含cdr的肽的抗原结合片段。

76、一些实施方案中，还提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与前述任一项所述抗cd25抗体或其抗原结合片段竞争结合人cd25，或竞争结合相同的表位。

77、一些实施方案中，提供抗cd25抗体或其抗原结合片段，其包含vh和/或vl，其中：

78、所述vh如seq id no：1所示，所述vl如seq id no：2所示；

79、所述vh如seq id no：3所示，所述vl如seq id no：4所示；

80、所述vh如seq id no：5所示，所述vl如seq id no：6所示；

81、所述vh如seq id no：9所示，所述vl如seq id no：10所示；或

82、所述vh如seq id no：11所示，所述vl如seq id no：12所示；所述抗体或其抗原结合片段阻断或部分阻断il-2与cd25的结合。

83、另一些实施方案中，提供抗cd25抗体或其抗原结合片段，其包含vh和/或vl，其中：

84、所述vh如seq id no：7所示，所述vl如seq id no：8所示；

85、所述vh如seq id no：13所示，所述vl如seq id no：14所示；

86、所述vh如seq id no：15所示，所述vl如seq id no：16所示；

87、所述vh如seq id no：17所示，所述vl如seq id no：18所示；

88、所述vh如seq id no：19所示，所述vl如seq id no：20所示；

89、所述vh如seq id no：21所示，所述vl如seq id no：22所示；

90、所述vh如seq id no：23所示，所述vl如seq id no：24所示；

91、所述vh如seq id no：25所示，所述vl如seq id no：26所示；

92、所述vh如seq id no：59所示，所述vl如seq id no：60所示；

93、所述vh如seq id no：59所示，所述vl如seq id no：63所示；或

94、所述vh如seq id no：59所示，所述vl如seq id no：64所示；所述抗体或其抗原结合片段不阻断、不抑制，几乎不阻断、不抑制，或较低程度的阻断、抑制il-2与cd25的结合。例如，与不存在抗体的情况下的il-2信号传导相比，所述抗cd25抗体或抗原结合片段阻断小于约50％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％的il-2信号传导，例如小于约25％的il-2信号传导。

95、一些实施方案中，提供抗cd25抗体或其抗原结合片段变体，其包含vh和/或vl，所述vh和/或vl与前述抗cd25抗体或其抗原结合片段的vh和/或vl具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

96、一些实施方案中，提供抗cd25抗体或其抗原结合片段变体，其包含vh和/或vl，所述vh和/或vl与前述抗cd25抗体或其抗原结合片段的重链可变区vh和/或vl相比，分别包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化。所述氨基酸变化可以是可变区中的氨基酸残基保守性置换。一些实施方案中，上述包含氨基酸变化的抗体或抗原结合片段与亲本抗体或抗原结合片段具有相同或基本相同的与人cd25结合的亲和力和\或功能(例如adcc、adcp、抗肿瘤活性)。

97、一些实施方案中，抗cd25抗体或其抗原结合片段包含重链和/或轻链，其中，

98、所述重链如seq id no：51所示，所述轻链如seq id no：52所示；

99、所述重链如seq id no：53所示，所述轻链如seq id no：54所示；

100、所述重链如seq id no：55所示，所述轻链如seq id no：56所示；

101、所述重链如seq id no：57所示，所述轻链如seq id no：58所示；

102、所述重链如seq id no：61所示，所述轻链如seq id no：62所示；

103、所述重链如seq id no：61所示，所述轻链如seq id no：67所示；或

104、所述重链如seq id no：61所示，所述轻链如seq id no：68所示。

105、一些实施方案中，提供抗cd25抗体或其抗原结合片段，其包含重链和/或轻链，所述重链和/或轻链与前述抗cd25抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链分别具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

106、一些实施方案中，本公开的抗cd25抗体或其抗原结合片段是igg1型，fc区具有去岩藻糖化位点，具有增强的fcγriiia结合能力。上述抗cd25抗体或其抗原结合片段能增加对treg细胞的adcc作用，增强其抗肿瘤活性。

107、一些实施方案中，本公开的抗cd25抗体或其抗原结合片段是igg1型，fc区具有去岩藻糖化位点(例如a330i突变)，具有降低的fcγriib结合能力。上述抗cd25抗体或其抗原结合片段能降低fcγriib受体介导的对adcc/adcp抑制性信号，以增强对treg细胞的adcc作用，增强其抗肿瘤活性。

108、一些实施方案中，本公开的抗cd25抗体或抗原结合片段具有下述特征中的至少一个：

109、(a)结合人cd25的kd值小于1×10-7m；

110、(b)不抑制(或基本上不抑制)il-2与cd25的结合；

111、(c)消耗肿瘤浸润性treg，不影响(或基本上不影响)teff的功能；

112、(d)以高于1的活化抑制率(a/i)结合fcγ受体；

113、(e)以比结合fcγri、fcγriic和/或fcγriib更高的亲和力结合fcγriiia，以比结合fcγriib更高的亲和力结合fcγriiia；

114、(f)抑制多种肿瘤生长。

115、本公开的cd25结合蛋白或抗cd25抗体结合cd25的kd值可以小于1×10-7m，小于1×10-8m，小于1×10-9m，或小于1×10-10m。

116、本公开的抗cd25抗体或其抗原结合片段能够抑制肿瘤生长至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％。

117、一些实施方案中，本公开的抗cd25抗体或抗原结合片段以高亲和力结合fcγr，例如，以高亲和力结合活化受体。一些具体实施方案中，本公开的抗体以高亲和力结合fcγri和/或fcγriia和/或fcγriiia。在具体的实施方式中，抗体与至少一种活化性fcγ受体以小于约10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m的解离常数结合。

118、一些实施方案中，本公开的抗cd25抗体或抗原结合片段是igg1抗体，能够与至少一种fc活化受体结合。例如，该抗体可与选自fcγri、fcγriia、fcγriic、fcγriiia和fcγriiib中的一种或多种受体结合。在一些具体实施方案中，本公开的抗体能够与fcγriiia结合。一些实施方案中，本公开的抗体能够与fcγriiia和fcγriia和任选的fcγri结合。在一个方面，抗体能够以高亲和力与这些受体结合，例如以小于约10-7m、10-8m、10-9m或10-10m的解离常数结合。

119、一些实施方案中，本公开的抗cd25抗体或抗原结合片段以低亲和力结合抑制性受体fcγriib。在一个方面，抗体以高于约10-7m、高于约10-6m或高于约10-5m的解离常数结合fcγriib。

120、一些实施方案中，本公开的抗cd25抗体或抗原结合片段来自igg1亚类，优选具有adcc和/或adcp活性。在另一些实施方案中，本公开的抗cd25抗体来自igg2亚类。

121、一些实施方案中，本公开的抗cd25抗体或抗原结合片段抑制或阻断少于50％的通过cd25的il-2信号传导。例如，与不存在抗体的情况下的il-2信号传导相比，抗cd25抗体或抗原结合片段抑制或阻断小于约40％、35％、30％，优选小于约25％的il-2信号传导。

122、多核苷酸和载体

123、本公开提供经分离的多核苷酸，其编码本公开的抗cd25抗体或其抗原结合片段。所述多核苷酸可以是dna或rna。

124、本公开提供含有如上所述的多核苷酸的表达载体，表达载体可以是真核表达载体、原核表达载体、病毒载体，例如质粒、粘粒、噬菌体。

125、宿主细胞

126、本公开提供用如上所述的表达载体转化的宿主细胞，其可以是真核细胞、原核细胞。

127、一些实施方案中，所述宿主细胞为细菌、酵母菌、哺乳动物细胞。一些具体实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌、毕赤酵母、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或人胚肾(hek)293细胞。

128、制备方法

129、本公开提供一种用于制备抗cd25抗体或其抗原结合片段的方法包括：在如前所述的宿主细胞中表达该抗体或其抗原结合片段，并自该宿主细胞中分离该抗体或其抗原结合片段。

130、可选地，还可以包含纯化步骤，例如，用含调整过的缓冲液的a或g sepharose ff柱进行纯化，洗去非特异性结合的组分，再用ph梯度法洗脱结合的抗体，用sds-page检测，收集。可选地，用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。

131、生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南(5-8章和15章)。如，可以用人fcrn或其片段免疫小鼠，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。

132、本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cdna序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染cho细胞。哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在fc区的高度保守n端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛，离子交换。

133、组合物

134、本公开提供一种组合物，例如药物组合物，其含有治疗有效量的如上所述的抗cd25抗体或其抗原结合片段和可药用的赋形剂、稀释或载体。在一些具体实施方式中，所述药物组合物单位计量中可含有0.01至99重量％的抗cd25抗体或其抗原结合片段，或药物组合物单位剂量中含抗cd25抗体或其抗原结合片段的量为0.1-2000mg，在一些具体实施方式中为1-1000mg。

135、治疗方法和制药用途

136、本公开提供抗cd25抗体或其抗原结合片段、含有所述抗cd25抗体或其抗原结合片段的药物组合物、编码多核苷酸中的任一项或其任意组合，用于诊断、治疗、预防疾病的方法和制备药物、药物组合物的用途(例如，用于治疗或预防增殖性病症(例如癌症或肿瘤)或延缓相关病症进展。

137、一些实施方案中，提供预防、治疗或缓解受试者病症的方法，包含向所述受试者施用本公开的抗cd25抗体或其抗原结合片段、含有所述抗cd25抗体或其抗原结合片段的药物组合物和/或编码多核苷酸。一些具体实施方案中，所述受试者病症是增殖性疾病，例如肿瘤或癌症。一些实施方案中，上述受试者患有已形成的肿瘤，例如实体瘤。

138、一些实施方案中，提供减少受试者肿瘤内部或肿瘤侵润性treg的细胞数量方法；一些实施方案中，提供消除或抑制受试者肿瘤内部或肿瘤侵润性的treg的细胞活性的方法，均包括向所述受试者施用本公开的抗cd25抗体或其抗原结合片段、含有所述抗cd25抗体或其抗原结合片段的药物组合物和/或编码多核苷酸。

139、一些实施方案中，提供增加受试者肿瘤内部teff/treg的比例的方法，包括向所述受试者施用本公开的抗cd25抗体或其抗原结合片段、含有所述抗cd25抗体或其抗原结合片段的药物组合物和/或编码多核苷酸。在一些具体实施方式中，肿瘤中效应t细胞与调节性t细胞的比例(teff/treg)增加至超过5、10、15、20、40或80。

140、一些实施方案中，提供增强受试者体内针对肿瘤细胞的cdc、adcc和/或adcp的方法，包括向所述受试者施用本公开的抗cd25抗体或其抗原结合片段、含有所述抗cd25抗体或其抗原结合片段的药物组合物和/或编码多核苷酸。一些具体实施方案中，受试者体内针对肿瘤细胞的adcc和/或adcp效应增强。一些更具体实施方案中，受试者体内针对肿瘤细胞的adcc效应增强。

141、一些实施方案中，提供本公开抗cd25抗体或其抗原结合片段、含有所述抗cd25抗体或其抗原结合片段的药物组合物和/或编码多核苷酸用于制备预防、治疗或缓解受试者病症的制药用途，用于制备减少受试者肿瘤内部或肿瘤侵润性treg的细胞数量的制药用途，用于制备消除或抑制受试者肿瘤内部或肿瘤侵润性的treg的细胞活性的药物的制药用途，用于制备增加受试者肿瘤内部teff/treg的比例的制药用途，用于制备增强受试者体内针对肿瘤细胞的cdc、adcc和/或adcp的制药用途。

142、一些具体实施方案中，上述受试者的病症为增殖性病症(例如癌症或肿瘤)或患有增殖性病症(例如癌症或肿瘤)。所述肿瘤包括但不限于癌、淋巴瘤、白血病、胚细胞瘤和肉瘤。这类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞癌(hcc)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病(aml)、多种骨髓瘤、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝脏癌、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞白血病、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和头颈癌。

143、一些具体实施方案中，所述癌症或肿瘤可以是实体瘤，包括但不限于肉瘤(包括由组织(例如松质骨、软骨、脂肪、肌肉、血管、造血细胞或纤维结缔组织)中的间充质来源的转化细胞产生的癌症)、癌(包括由上皮细胞产生的肿瘤)、间皮瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等。涉及实体瘤的癌症包括但不限于，脑癌、肺癌、胃癌、十二指肠癌、食道癌、乳腺癌、结肠和直肠癌、肾癌、膀胱癌、肾脏癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、口腔癌、肉瘤、眼癌、甲状腺癌、尿道癌、阴道癌、颈癌、淋巴瘤等。

144、一些具体实施方案中，所述癌症涉及表达cd25的肿瘤，包括但不限于淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤和淋巴细胞性白血病，例如慢性淋巴细胞白血病(cll)。

145、检测用途

146、本公开提供抗cd25抗体或其抗原结合片段的检测用途。

147、本公开提供检测cd25的试剂，所述试剂包含抗cd25抗体或其抗原结合片段。本公开还提供用于体内或体外检测cd25的方法、系统或装置，其包括使用抗cd25抗体或其抗原结合片段。

148、一些实施方案中，体外检测方法、系统或装置可能例如包括(1)使样品与抗cd25抗体或其抗原结合片段接触；(2)检测在抗cd25抗体或其抗原结合片段和样品之间形成的复合物；和/或(3)使参比样品(例如，对照样品)与抗体接触；和(4)通过与参比样品比较，确定抗体和样品之间复合物形成的程度。如与对照样品或受试者中相比，样品或受试者中复合物形成的变化(例如，统计学上的显著变化)表示样品中存在cd25。

149、一些实施方案中，出于检测目的，本公开的cd25结合蛋白或抗cd25抗体可以用荧光团和发色团标记。

150、一些实施方案中，还提供试剂盒，所述试剂盒包含与cd25结合蛋白或抗cd25抗体，还可以包含诊断使用说明。试剂盒还可以含有至少一种额外的试剂，如标记物或额外的诊断剂。对于体内使用，抗体可以配制为药物组合物。

151、本公开实施例提供的抗cd25抗体或其抗原结合片段具有高特异性、高亲和力、低免疫原性的特点。同时，本公开的抗体具有良好的抑制treg，不影响teff，增强受试者体内adcc、adcp和\或cdc，抑制肿瘤发生发展的效果。

152、在一些实施方案中，提供如下抗cd25抗体、其抗原结合片段，及其编码核酸、载体、宿主细胞、药物组合物、用于治疗癌症的方法和制药用途：

153、[1]一种抗cd25抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，其中：

154、1)所述vh含有seq id no：59中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，和所述vl含有seq id no：63中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

155、2)所述vh含有seq id no：59中的hcdr1、hcdr2和hcdr3，和所述vl含有seq id no：64中的lcdr1、lcdr2和lcdr3；

156、所述cdr是根据kabat、imgt、chothia、abm或contact编号系统定义的；优选地，所述cdr是根据kabat编号系统定义的。

157、[2]一种抗cd25抗体或其抗原结合片段，包含vh和vl，其中：

158、所述vh包含分别如seq id no：45、46、47所示的hcdr1、hcdr2、hcdr3，和所述vl包含分别如seq id no：65、49、50所示的lcdr1、lcdr2、lcdr3，或所述vl包含分别如seq idno：66、49、50所示的lcdr1、lcdr2、lcdr3。

159、[3]如[1]-[2]任一项所述的抗cd25抗体或其抗原结合片段，其中所述抗cd25抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体，优选为人源化抗体。

160、[4]如[1]-[2]任一项所述的抗cd25抗体或其抗原结合片段，其中所述vh包含选自ighv3-23*04的fr1至fr3、选自ighj1*01的fr4，和所述vl包含选自igkv2-28*01的fr1至fr3和选自igkj4*01的fr4。

161、[5]如[1]-[4]中任一项所述的抗cd25抗体或其抗原结合片段，其中：

162、所述vh如seq id no：59所示或与之具有至少90％、至少95％序列同一性，和所述vl如seq id no：63或64任一所示或与之具有至少90％、至少95％序列同一性。

163、[6]如[1]-[5]中任一项所述的抗cd25抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为scfv、fv、fab或fab’片段。

164、[7]如[1]-[5]中任一项所述的抗cd25抗体或其抗原结合片段，其中所述抗cd25抗体为igg抗体，优选为igg1、igg2、igg4；

165、优选地，所述抗cd25抗体在fc区具有去岩藻糖化位点，以增强与fcγriiia的结合能力，和/或降低与fcγriib的结合能力；

166、更优选地，所述去岩藻糖化位点为297位。

167、[8]如[1]-[7]中任一项所述的抗cd25抗体或其抗原结合片段，包含重链和轻链，其中所述重链如seq id no：61所示或与之具有至少80％、至少90％、至少95％序列同一性，和所述轻链如seq id no：67或68任一所示或与之具有至少80％、至少90％、至少95％序列同一性。

168、[9]如[1]-[8]中任一项所述的抗cd25抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗cd25抗体或其抗原结合片段具有下述特征中的至少一项：

169、(a)结合人cd25的kd值小于1×10-7m；

170、(b)不抑制或基本上不抑制il-2与cd25的结合；

171、(c)消耗肿瘤浸润性treg，不影响或基本上不影响teff的功能；

172、(d)以高于1的活化抑制率(a/i)结合fcγ受体；

173、(e)以比结合fcγri、fcγriic和/或fcγriib更高的亲和力结合fcγriiia，优选地，以比结合fcγriib更高的亲和力结合fcγriiia；

174、(f)抑制肿瘤生长；和

175、(g)引发增强的cdc、adcc和/或adcp反应；优选地，引发增加的adcc反应。

176、[10]一种抗cd25抗体或其抗原结合片段，其与[1]-[9]中任一项所述的抗cd25抗体或其抗原结合片段竞争性结合人cd25，或竞争性结合、或结合相同的人cd25表位。

177、[11]一种多核苷酸，其编码[1]-[10]中任一项所述的抗cd25抗体或其抗原结合片段。

178、[12]一种载体，其含有如[11]所述的多核苷酸。

179、[13]一种宿主细胞，其包含[12]所述的载体，

180、优选地，所述宿主细胞为细菌、酵母或哺乳动物细胞；

181、更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌、毕赤酵母、中国仓鼠卵巢细胞或人胚肾293细胞。

182、[14]一种制备抗cd25抗体或其抗原结合片段的方法，包括：

183、在[13]所述的宿主细胞中表达[1]-[10]任一项所述的抗cd25抗体或其抗原结合片段，以及

184、从所述宿主细胞中分离所述抗cd25抗体或其抗原结合片段。

185、[15]一种药物组合物，其含有：

186、[1]-[10]中任一项所述的抗cd25抗体或其抗原结合片段；

187、以及，一种或多种可药用的赋形剂、稀释剂或载体。

188、[16]选自以下的任一项或其任意组合在制备药物或药物组合物中的用途：

189、[1]-[10]中任一项所述的抗cd25抗体或其抗原结合片段，[11]所述的多核苷酸和[15]所述的药物组合物，其中所述药物或药物组合物用于治疗癌症。

190、[17]一种治疗患有癌症的受试者的方法，包括：

191、向受试者施用治疗有效量的[1]-[10]中任一项所述的抗cd25抗体或抗原结合片段、[11]所述的多核苷酸、[15]所述的药物组合物或其任意组合。

192、[18]一种减少受试者肿瘤内部或肿瘤侵润性treg细胞数量和/或抑制其活性的方法，包括：

193、向受试者施用治疗有效量的[1]-[10]任一项所述的抗cd25抗体或抗原结合片段、[11]所述的多核苷酸、[15]所述的药物组合物或其任意组合。

194、[19]一种增加受试者肿瘤内部teff/treg的比例的方法，包括：

195、向受试者施用治疗有效量的[1]-[10]任一项所述的抗cd25抗体或抗原结合片段、[11]所述的多核苷酸、[15]所述的药物组合物或其任意组合。

196、[20]一种增强受试者体内针对肿瘤细胞的cdc、adcc和/或adcp的方法，包括：

197、向受试者施用治疗有效量的[1]-[10]任一项所述的抗cd25抗体或抗原结合片段、[11]所述的多核苷酸、[15]所述的药物组合物或其任意组合。

198、[21]如[16]的用途和[17]-[20]任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症或肿瘤，

199、优选地，所述癌症或肿瘤选自鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞癌(hcc)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病(aml)、多种骨髓瘤、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝脏癌、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞白血病、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和头颈癌。

200、[22]一种在体内或体外检测cd25的方法，所述方法包括使用[1]-[10]中任一项所述的抗cd25抗体或抗原结合片段、和/或[11]所述的多核苷酸，

201、优选地，如果cd25存在，检测所述抗cd25抗体或抗原结合片段、多核苷酸和所述cd25之间的相互作用。

202、[23]一种用于检测cd25的试剂盒，其包含[1]-[10]中任一项所述的抗cd25抗体或抗原结合片段和\或[11]所述的多核苷酸。