一种鱼类抗冻肽及其基于分子模拟筛选的方法和应用

本发明涉及多肽，尤其涉及一种鱼类抗冻肽及其基于分子模拟筛选的方法和应用。

背景技术：

1、低温保存是食品和生物医药领域中最广泛应用的贮藏手段。但是，食品不可避免地会在冷冻保存过程中生长和低温运输过程中重结晶。

2、抗冻蛋白是一类在结冰或亚结冰状态下能保护生物体免受伤害蛋白质，它能非依数性降低溶液冰点、有效抑制冰晶生长和重结晶的发生，抑制冻结所造成的低温损伤。抗冻肽是抗冻蛋白中具有活性的结构域部位，类似于抗冻蛋白具有对生物体的独特冷冻保护能力。抗冻肽是一类小分子蛋白或蛋白质水解物，由于天然源抗冻蛋白含量甚微，通过生物酶解技术，获取特异性多肽链结构域片段，生产成本低且性能稳定。相较于数量有限与价格昂贵的抗冻蛋白，抗冻肽更具有应用前景。

3、鲷鱼是我国重要的经济鱼类，广泛分布于我国海域。在罐头和鱼制品的生产过程中，会产生大量的碎屑和无用的鳞片。鱼鳞下脚料通常作为废弃物处理，不仅浪费资源，而且污染环境。鲷鱼鳞富含胶原蛋白，可作为活性肽生产来源。利用鲷鱼鳞开发制备抗冻肽，不仅充分利用资源，提高鱼类加工的附加值，而且还符合绿色协调可持续发展的理念，促进鱼类加工业的发展。与传统的哺乳动物源胶原蛋白抗冻肽相比，鱼源胶原蛋白抗冻肽更具安全性。目前，利用犁齿鲷鱼鳞制备抗冻肽的工艺迄今为止尚未见报道。

技术实现思路

1、(一)要解决的技术问题

2、鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种鱼类抗冻肽，其具有优异的抗冻特性，其来源于犁齿鲷鱼鳞，为新的鱼鳞抗冻肽；

3、相应地，本发明还提供一种基于分子模拟筛选鱼类抗冻肽的方法，其通过与冰晶的分子对接筛选得到特定氨基酸序列的犁齿鲷鱼鳞高活性抗冻肽，方法简单高效便捷，成本低。

4、相应地，本发明还提供一种鱼类抗冻肽作为抗冻产品的应用。

5、(二)技术方案

6、为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

7、第一方面，本发明提供一种鱼鳞抗冻肽，其氨基酸序列为：gpgekgpqgpag。

8、可选地，犁齿鲷鱼鳞抗冻肽与冰晶形成氢键的位点包括gly3和gln8。

9、可选地，其具有α螺旋结构。

10、第二方面，本发明还提供上述任一方案中基于分子模拟筛选鱼类抗冻肽的方法，其包括以下步骤：

11、s1犁齿鲷鱼鳞抗冻肽初提物经质谱分析得到的肽序列；

12、s2肽序列与冰晶棱面通过分子对接软件筛选得到的最优构象肽序列；

13、s3三维分析下，以形成的氢键数量为指标，从最优构象肽序列筛选得到的抗冻肽序列。

14、本发明在筛选得到的最优构象肽序列之后，直接通过肽序列与冰晶形成的氢键数量为指标，可筛选得到抗冻肽序列；抗冻肽与冰晶作用的最重要的化学键为氢键，通过氢键数量可直接筛选得到具有抗冻活性的肽序列。本发明还通过肽序列与冰晶的对接总能量(指的是肽跟冰晶对接的作用能；在多肽序列相同的前提下，对接总能量的绝对值越高代表体系相对稳定)辅助筛选。

15、其中，分子对接软件可以是分子对接软件hex8.0.0。

16、其中，三维分析使用三维分析软件，包括pymol、discovery studio和vmd。

17、可选地，筛选方法还包括以下步骤：在步骤s2前，肽序列通过蛋白质数据库筛选得到的具有胶原蛋白源的肽序列。本发明过滤非胶原蛋白源的肽序列，源于本发明犁齿鲷鱼鳞多肽为胶原蛋白源的多肽，可过滤仪器等残留物为非犁齿鲷鱼鳞多肽对筛选结果的影响。蛋白质数据库优选为cryoprotect数据库。

18、可选地，筛选方法还包括以下步骤：在步骤s2前，肽序列通过rpbs结构生物学数据库中pep-fold 3.5多肽结构预测建模程序进行建模，选择模拟次数100，模型排序依据sopep；以评分最高的建模结果作为最终结构，筛选得到具有二级结构的肽序列。

19、可选地，抗冻肽初提物的制备包括以下步骤：犁齿鲷鱼鳞粉加水制成的鱼鳞浆料液，调节ph值至弱碱性，加入胰蛋白酶36～38℃下酶解4～6h，制得的降解物。

20、犁齿鲷鱼鳞与超纯水混合浓度为1.57％(w/v)；

21、调节ph为8.0；

22、胰蛋白酶的酶底比5.89％(w/w)。

23、可选地，抗冻肽初提物的制备包括以下步骤：犁齿鲷鱼鳞降解物冰亲和吸附制得抗冻肽初提物。通过冰亲和吸附方法可提高所得抗冻肽初提物抗冻肽的纯度。

24、可选地，筛选方法还包括以下步骤：在步骤s2前，肽序列通过抗冻多肽数据库进行初步筛选得到的肽序列。其中，抗冻多肽数据库优选为cryoprotect数据库，过滤去除不具有冷冻保护活性的多肽序列；cryoprotect数据库筛选的准确率虽然仅有88.28％。但是本发明通过步骤s2和s3的组合可以克服cryoprotect数据库筛选的准确率仅有88.28％的技术问题。

25、可选地，筛选方法还包括以下步骤还包括以下步骤：在步骤s2前，肽序列通过多肽毒性数据库筛选得到无毒性、亲水性＞0的肽序列。为了简化后续步骤的筛选，本发明可优先通过toxinpred数据库筛选亲水性和无毒性的序列。由于抗冻肽需要在溶液体系下起作用，因此亲水性和无毒性的筛选，可准确的去除难溶或者不溶于水的抗冻活性多肽。

26、第三方面，本发明还提供上述任一方案中，所述鱼类抗冻肽在抗冻产品的应用。

27、抗冻产品可以用于保健品、食品中。

28、本发明利用肽组学和分子对接的方法，简化了分离纯化等繁琐的步骤，节省了昂贵的仪器耗材使用，从犁齿鲷鱼鳞酶解物中高效便捷地筛选出具有特定氨基酸序列的高活性抗冻肽。以食源性下脚料进行抗冻肽的可控酶解制备，降低成本的同时有利于实现抗冻肽的规模化生产和应用，为应用于食品、保健品和低温组织工程提供理论支撑。

29、(三)有益效果

30、本发明的有益效果是：

31、1.本发明提供的犁齿鲷鱼鳞抗冻肽，弥补了犁齿鲷鱼鳞抗冻肽的空白，并且其具有高抗冻活性，其热滞活性值在0.2-0.4℃之间，可作为抗冻剂等产品的应用。

32、2.本发明提供的新的抗冻肽的筛选方法，其结合生物学信息，通过冰晶和多肽的分子对接筛选最优构象，在此基础之上，通过肽序列与冰晶形成的氢键数量为指标，可筛选得到抗冻肽序列，其具有简化了分离纯化等繁琐的步骤，方法简单、生产成本低、筛选速度快、准确性高的优点。

33、本发明进一步通过相应地数据库筛选无毒性、亲水性＞0的肽序列、具有冷冻保护活性的肽序列、具有二级以上结构的序列、胶原蛋白源的肽序列；提高高活性肽序列的筛选效率和得率。

技术特征：

1.一种鱼类抗冻肽，其特征在于，其氨基酸序列为：gpgekgpqgpag。

2.如权利要求1所述鱼类抗冻肽，其特征在于，其与冰晶形成氢键的位点包括gly3和gln8。

3.如权利要求2所述抗冻肽，其特征在于：gly3位点与冰晶形成3个氢键。

4.一种基于分子模拟筛选鱼类抗冻肽的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

5.权利要求4所述基于分子模拟筛选鱼类抗冻肽的方法，其特征在于，其还包括以下步骤：在步骤s2前，肽序列通过蛋白质数据库筛选得到的具有胶原蛋白源的肽序列。

6.如权利要求4所述基于分子模拟筛选鱼类抗冻肽的方法，其特征在于，其还包括以下步骤：在步骤s2前，肽序列通过rpbs结构生物学数据库中pep-fold 3.5多肽结构预测建模程序进行建模，选择模拟次数100，模型排序依据sopep；以评分最高的建模结果作为最终结构，筛选得到具有二级结构的肽序列。

7.如权利要求4所述基于分子模拟筛选鱼类抗冻肽的方法，其特征在于，抗冻肽初提物的制备包括以下步骤：犁齿鲷鱼鳞粉加水制成的鱼鳞浆料液，调节ph值至弱碱性，加入胰蛋白酶36～38℃下酶解4～6h，制得的降解物；所述降解物通过冰亲和吸附方法制得抗冻肽初提物。

8.如权利要求4所述基于分子模拟筛选鱼类抗冻肽的方法，其特征在于，其还包括以下步骤：在步骤s2前，肽序列通过抗冻多肽数据库进行初步筛选得到的肽序列。

9.如权利要求4所述基于分子模拟筛选鱼类抗冻肽的方法，其特征在于，其还包括以下步骤：在步骤s2前，肽序列通过多肽毒性数据库筛选得到无毒性、亲水性＞0的肽序列。

10.一种如权利要求1所述鱼类抗冻肽在抗冻产品中的应用。

技术总结
本发明涉及多肽技术领域，尤其涉及本发明涉及多肽技术领域，尤其涉及一种鱼类抗冻肽及其基于分子模拟筛选的方法和应用。鱼类抗冻肽，其氨基酸序列为：GPGEKGPQGPAG；筛选方法为：犁齿鲷鱼鳞抗冻肽初提物经质谱分析得到的肽序列；肽序列与冰晶棱面通过分子对接软件筛选得到的最优构象肽序列；三维分析下，以形成的氢键数量为指标，从最优构象肽序列筛选得到的抗冻肽序列。本发明提供的抗冻肽，并且其具有高抗冻活性，可作为抗冻剂等产品的应用。本发明的筛选方法其具有简化了分离纯化等繁琐的步骤，方法简单。

技术研发人员：汪少芸,江文婷,陈旭,蔡茜茜,杨傅佳,田韩
受保护的技术使用者：福州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13