一种小麦族物种Ns基因组特异KASP分子标记引物及其应用

本发明涉及分子标记辅助育种，具体涉及一种小麦族物种ns基因组特异kasp分子标记引物及其应用。

背景技术：

1、小麦(triticumaestivuml.)是世界上种植面积最大、总产量仅次于玉米的粮食作物(葛江燕，2012)，为全球约40％的人口提供了能量来源(lietal.2019)。但是近年来随着耕作制度的变化及育种中少数亲本的反复使用，导致小麦的遗传多样性降低，对生物胁迫和非生物胁迫抗性降低，制约了小麦产量和品质的提高，难以育成突破性品种(jiangetal.1993；何中虎等，2011)。小麦近缘物种中蕴藏着丰富的优良基因，通过远缘杂交的方式将其优良基因导入到普通小麦，可以丰富小麦的遗传多样性(刘成等，2020)。

2、小麦族物种包含多种重要种属，涉及多种基因组组成。新麦草属是小麦族中非常重要的ns基因组供体属，赖草属则为异源多倍体的大属，含有来自新麦草属物种的ns基因组(颜济，杨俊良，2011)。我国现有4种新麦草属物种，包括华山新麦草(psathyrostachyshuashanica)、毛穗新麦草(psathyrostachyslanuginose)、单花新麦草(psathyrostachyskronenburgii)和新麦草(psathyrostachysjuncea)，现有研究主要集中于华山新麦草和新麦草(盛誉，2020)。华山新麦草因其具有抗病(条锈病、秆锈病、白粉病、全蚀病)、抗逆(耐寒、耐旱、耐盐碱)、早熟、矮秆、多分蘖等优良特性已被广泛应用于小麦遗传改良(baden1991，黄娟等，2019)。新麦草分蘖多、叶量大、抗性好、早春且反青和再生性能好，其资源利用研究主要集中与牧草和小麦改良(范亚坤等，2020；陈勤等，1988)。赖草属包含60多种，广泛分布与全球各地。该属植物多数物种为草原和草甸的主要组成成分；许多种类因具有较高的饲用价值已作为优良牧草利用(张立，2015)。同时，因赖草属植物常生长在盐碱地和干旱地区，对寒冷、干旱、盐碱土等环境具有高度适应性，部分物种还具有抗病虫、穗大、粒多、高光效、高氮素利用率等优良特性(葛荣朝等，2001；subbaraoetal.2021)。目前，大赖草(leymus racemosus)、多枝赖草(leymusmulticaulis)和滨麦pi567896(leymusmollis)已经和小麦成功杂交并获得了部分农艺性状优异的附加系、代换系和渗入系等异染色体系(liuetal.2002；zhaoetal.2013；subbaraoetal.2021；yangetal.2020；lietal.2021；jinetal.2021)。

3、在种质资源利用过程中，分子标记已被广泛用于外源染色体或染色体片段的检测与跟踪，加速种质创新(fedaketal.1999)。目前，ns基因组物种特异分子标记主要有华山新麦草rapd(randomamplifiedpolymorphic dna)标记、scar(sequencecharacterizedamplifiedregions)标记和普通pcr(polymerasechainreaction)标记；新麦草特异rapd标记；大赖草特异rapd标记、snp(singlenucleotidepolymorphism)标记和普通pcr标记以及滨麦est-ssr(expressedsequencetag-simplesequencerepeat)标记、sts(sequence-taggedsite)标记、普通pcr标记和snp标记(陈林刚等，2010；duetal.2013；tanetal.2022；edetetal.2018a；2018b)。目前，转录组测序技术已广泛应用于snp挖掘并开发kasp标记引物(wangetal.2017；zhouetal.2017；okadaetal.2018)，而利用转录组测序技术获得snp变异并开发小麦族物种中ns基因组特异kasp标记引物还未见报道，这严重阻碍小麦族物种中ns基因组物种优异基因资源的开发与利用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种小麦族物种ns基因组特异kasp分子标记引物及其应用，该分子标记引物不仅可用于普通小麦背景中ns基因组的快速检测，也可用于小麦族所有包含ns基因组物种的染色体或染色体片段的鉴定，且能准确鉴定区分ns和其他小麦近缘物种基因组，为小麦族系统进化、种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种提供了重要途径。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种华山新麦草ns染色体特异kasp分子标记引物，该分子标记引物包含两个引物组，分别为引物组kp1a-440448839和引物组kp4d-349184744，这两个引物组分别包含f-fam、f-hex、r三条引物，其中，引物组kp1a-440448839包含的引物，其核苷酸序列依次分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示；引物组kp4d-349184744包含的引物，其核苷酸序列依次分别如seq idno.4、seq id no.5和seq id no.6所示。

3、本发明还提供了一种华山新麦草ns染色体的基因分型方法，该方法通过采用上述的两个引物组对待测株系的基因组dna进行pcr扩增。

4、优选地，上述基因分型方法中的pcr扩增条件如下：

5、pcr反应体系为10μl：200ng/μl的dna模板1μl，10μm的混合引物1.4μl，2×kaspmastermix5μl，ddh2o2.6μl。

6、pcr反应程序为：95℃10min；95℃20s，61℃45s，10个循环，每个循环降低0.6℃；95℃20s，55℃45s，32个循环；25℃1min；95℃20s,55℃40s，3个循环；30℃30s。

7、其中，上述混合引物的体系为100μl：包含f-fam和f-hex引物各12μl，r引物30μl，h2o46μl。

8、本发明还提供了一种用于鉴定华山新麦草ns染色体的试剂盒，该试剂盒包含上述的引物组kp1a-440448839和引物组kp4d-349184744。

9、本发明提供的kasp分子标记引物可被用于以下任意一种：

10、①检测华山新麦草ns染色体；

11、②检测含有华山新麦草ns染色体的产品；

12、③追踪华山新麦草ns染色体；

13、④追踪含有华山新麦草ns染色体的产品；

14、⑤分子标记辅助选择育种；

15、⑥制备分子标记辅助选择育种的产品；

16、⑦小麦分子育种；或

17、⑧制备小麦分子育种的产品。

18、本发明的小麦族物种ns基因组特异kasp分子标记引物，解决了小麦族物种ns基因组的鉴定问题，具有以下优点：

19、本发明利用rna测序技术对华山新麦草进行测序，通过序列比对分析，挖掘了华山新麦草与小麦中国春间的snp变异，基于snp位点信息和普通小麦中国春参考基因组信息，设计引物并在普通小麦、华山新麦草和10种小麦族物种中验证，获得小麦族物种ns基因组特异的kasp分子标记引物。本发明开发的kasp分子标记引物不仅可用于普通小麦背景中ns基因组的快速检测，也可用于小麦族所有包含ns基因组物种的染色体或染色体片段鉴定，且能准确鉴定区分ns和其他小麦近缘物种基因组，这为小麦族系统进化、种质资源鉴定和分子标记辅助选择育种提供了重要途径。