复制型腺病毒的检测方法及试剂盒与流程

本发明属于生物制品领域和基因检测领域，具体地，本发明提供了对腺病毒载体制品中复制型腺病毒(rca)进行定量检测的方法、引物对和探针组合，及相应试剂盒。

背景技术：

1、重组腺病毒载体因其高的生物安全性、对人无致病性而成为一种应用广泛的基因治疗载体。目前通常所用的腺病毒载体是去除了e1/e3等与腺病毒复制相关的基因，由包装细胞如hek293提供e1等基因来保证非复制型的腺病毒的包装和扩增，从而增加了使用的安全性。

2、尽管如此，在病毒基因治疗载体的生产过程中，可能因随机突变或其他事件形成不需要的具有复制能力的病毒(“rca”)。例如，e1a缺失的腺病毒载体可以在hek293细胞中生产，该细胞包含功能性e1a区域。自发重组理论上可以将功能性e1a区域重新添加回腺病毒中，创建具有复制能力的腺病毒(“rca”)。rca代表生物危害，因为如同野生型ad，它可以在感染的宿主中复制且潜在地可能引起疾病。

3、因此，病毒基因治疗载体生产商测定复制缺陷病毒载体是否存在污染性rca。目前大部分监管机构要求通过使用通常a549细胞培养的方法测定，这种方法操作复杂，需要连续培养10天获得结果，结果评价方法为观察噬斑，结果受人为因素影响较大。

4、为了得到改进型的替代方法，本领域已经进行了诸多尝试，其中，实时定量pcr技术具有检测微量杂质所需的灵敏度。例如，参见于雷等，q-pcr法检测腺病毒基因治疗产品中的复制型腺病毒，生物技术通讯第28卷第3期(2017年5月)，该文献中建立了一种探针法qpcr体系，对腺病毒载体制品中rca的拷贝数进行相对定量测定。上述方法的不足之处是，仅扩增单个目的基因e1a，不能准确评估rca相对于腺病毒载体制品的含量。

5、因此本领域急需开发一种高灵敏度、高特异性、低变异性的可靠的腺病毒载体制品中rca含量的检测方法。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明提供了一种对腺病毒载体制品中复制型腺病毒(rca)进行定量检测的方法，及相应试剂盒。

2、在一个方面，本发明提供了一种对腺病毒载体制品中rca进行定量检测的方法，所述方法包括步骤：(1)获取包含腺病毒载体制品的样品；(2)提取样品的总dna；(3)以腺病毒hexon和e1a基因为待扩增靶基因，进行双重荧光实时定量pcr，从而实现对腺病毒载体制品中rca进行相对定量检测。在一个优选的实施方案中，所述腺病毒载体制品不能和/或不应当在正常人细胞中复制，优选地所述腺病毒载体制品还包含野生型腺病毒基因组的至少一部分，以及外源基因。

3、在一些具体的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括可用于绘制标准曲线的阳性对照。在一些具体的实施方案中，所述阳性对照是质粒构建体pjet1.2-hexon-e1a-e1b55k。

4、在一些具体的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括用于扩增检测hexon靶基因的引物，其中所述引物包含hexon特异性正向引物和hexon特异性反向引物的引物对，所述正向引物在其3’最末端包含与hexon基因的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸相同的序列，所述反向引物在其3’最末端包含与hexon基因的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸反向互补的序列。在另一个实施方案中，所述正向引物的长度是15至100个核苷酸，或16至35个核苷酸、优选地17至25个核苷酸、更优选地18至22个核苷酸、最优选地18个核苷酸；所述反向引物的长度是15至100个核苷酸，或16至35个核苷酸、优选地17至25个核苷酸、更优选地18至23个核苷酸。

5、在一些优选的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括选自以下的用于扩增hexon靶基因的引物对：

6、a)

7、cgcatgtactccttctttaga(seq id：4)

8、ctgttggtagtccttgtatttag(seq id：5)

9、b)

10、gaccgcatgtactccttc(seq id：6)

11、gttggtagtccttgtatttagt(seq id：7)

12、c)

13、ccgcatgtactccttctt(seq id：8)

14、cctgttggtagtccttgtatt(seq id：9)

15、在一些具体的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括用于扩增检测e1a靶基因的引物，其中所述引物包含e1a特异性正向引物和e1a特异性反向引物的引物对，所述正向引物在其3’最末端包含与e1a基因的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸相同的序列，所述反向引物在其3’最末端包含与e1a基因的核苷酸序列中至少15个连续核苷酸反向互补的序列。在另一个实施方案中，所述正向引物的长度是15至100个核苷酸，或16至35个核苷酸、优选地17至25个核苷酸、更优选地18至22个核苷酸、最优选地18个核苷酸；所述反向引物的长度是15至100个核苷酸，或16至35个核苷酸、优选地17至25个核苷酸、更优选地18至23个核苷酸。

16、在一些优选的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括选自以下的用于扩增e1a靶基因的引物对：

17、a)

18、5’-acacctcctgagatacacccg-3’(seq id：10)

19、5’-gcaagtcctcgatacattccaca-3’(seq id：11)

20、b)

21、5’-atagctgtgactccggtccttc-3’(seq id：13)

22、5’-agcaagtcctcgatacattcca-3’(seq id：14)

23、c)

24、5’-cttgggtccggtttctatgc-3’(seq id：15)

25、5’-ttcatcctcgtcgtcactgg-3’(seq id：16)

26、在一些具体的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括用于检测提取的dna或实时定量pcr测定法的提取物或扩增产物之中的hexon基因和/或e1a基因的探针，其中探针的长度是16至35个核苷酸、优选地18至27个核苷酸、最优选地20-25个核苷酸。在一个优选的实施方案中，探针带有荧光报告基团和/或荧光淬灭基团。在一个更优选的实施方案中，荧光报告基团是hex或fam，荧光淬灭基团是bhq1或tamra。

27、在一些优选的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括选自以下的用于检测hexon靶基因的探针：

28、hex-catccaccacctgacggctc-bhq1(seq id：3)

29、在一些优选的实施方案中，所述方法的步骤(3)包括选自以下的用于检测e1a靶基因的探针：

30、a)

31、5’-fam-ctgtgccccattaaaccagttgccg-3’-bhq1(seq id：12)

32、b)

33、fam-5’-acctgccacgaggctggctttcc-3’tamra-3’(seq id：17)。

34、在一些实施方案中，本发明的对腺病毒载体制品中rca进行定量检测的双重荧光实时定量pcr方法具有选自以下一项或多项的特性：

35、(1)具有约90％-约110％之间的扩增效率；

36、(2)具有大于0.99的相关系数r2值，优选大于0.991、大于0.992、大于0.993、大于0.994、大于0.995、大于0.996、大于0.997、大于0.998、大于0.999；

37、(3)具有良好的重现性，例如体现为变异度cv％小于40％，优选小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、或小于10％；

38、(4)具有不高于5拷贝/μl的最低检测限。

39、因此，在另一个方面，本发明涉及引物对，探针，和/或包含引物对和探针的组合，其中引物对和探针具有如上文所述的含义和重要性。例如，在一个实施方案中，本发明提供了引物对，其选自以下任一组：

40、a)

41、cgcatgtactccttctttaga(seq id：4)

42、ctgttggtagtccttgtatttag(seq id：5)

43、c)

44、gaccgcatgtactccttc(seq id：6)

45、gttggtagtccttgtatttagt(seq id：7)

46、d)

47、ccgcatgtactccttctt(seq id：8)

48、cctgttggtagtccttgtatt(seq id：9)

49、优选地，所述引物对用于在pcr(例如，荧光实时定量pcr)方法中扩增腺病毒的hexon基因或其片段。

50、在一个实施方案中，本发明提供了引物对，其选自以下任一组：

51、a)

52、5’-acacctcctgagatacacccg(seq id：10)

53、5’-gcaagtcctcgatacattccaca(seq id：11)

54、b)

55、5’-atagctgtgactccggtccttc-3’(seq id：13)

56、5’-agcaagtcctcgatacattcca-3’(seq id：14)

57、c)

58、5’-cttgggtccggtttctatgc-3’(seq id：15)

59、5’-ttcatcctcgtcgtcactgg-3’(seq id：16)

60、优选地，所述引物对用于在pcr(例如，荧光实时定量pcr)方法中扩增腺病毒(例如，复制型腺病毒)的e1a基因或其片段。

61、在一个实施方案中，本发明提供了探针，其具有序列：hex-catccaccacctgacggctc-bhq1(seq id：3)，优选地，所述探针用于在核酸杂交(例如，荧光实时定量pcr)方法中检测腺病毒的hexon基因或其片段。

62、在一个实施方案中，本发明提供了探针，其具有选自以下的序列：

63、a)

64、5’-fam-ctgtgccccattaaaccagttgccg-3’-bhq1(seq id：12)

65、b)

66、fam-5’-acctgccacgaggctggctttcc-3’tamra-3’(seq id：17)

67、优选地，所述探针用于在核酸杂交(例如，荧光实时定量pcr)方法中检测腺病毒(例如，复制型腺病毒)的e1a基因或其片段。

68、在一个实施方案中，本发明提供了通过pcr检测rca的方法，所述方法包括使用样品中污染的rca基因组作为模板、使用反向引物和正向引物的引物对。在一个实施方案中，所述方法使用包含引物对和探针的组合。其中引物对(包括正向引物和反向引物)和探针具有如上文所述的意思。在一些实施方案中，样品具有不低于5拷贝/μl的e1a基因含量，从而被本发明的方法检测出。在一些实施方案中，样品具有不低于50拷贝/μl的e1a基因含量，从而被本发明的方法检测出。在一个实施方案中，样品中不含有任何污染的rca基因组，因而没有rca基因组被检出。

69、在一个实施方案中，本发明提供了一种评价腺病毒载体制品质量的方法，其中所述方法能够检测任何污染的rca基因组，如果其存在的话。

70、在一个实施方案中，本发明提供了组合物，以及组合物在用于评价腺病毒载体制品质量中的用途，其中，组合物由正向引物和反向引物的引物对，和/或探针组成，其中正向引物和反向引物和探针具有如上文所述的意思。

71、在一个实施方案中，本发明提供了正向引物和反向引物的引物对，和/或探针在制备检测剂中的用途，所述检测剂用于评价腺病毒载体制品质量，其中正向引物和反向引物和探针具有如上文所述的意思。

72、在另一方面，本发明提供了用于通过双重实时荧光定量pcr方法对腺病毒载体制品中复制型腺病毒(rca)进行定量检测的试剂盒，所述试剂盒包含特异性扩增检测hexon靶基因的引物和探针，以及特异性扩增检测e1a靶基因的引物和探针。本发明相应地提供了对腺病毒载体制品中复制型腺病毒(rca)进行定量检测的方法，包括步骤：对待测样品使用本发明的试剂盒进行双重实时荧光定量pcr方法。

73、在另一个实施方案中，本发明提供了用于评价腺病毒载体制品质量的试剂盒，所述试剂盒包含正向引物和反向引物组成的引物对，或探针，或其组合，其中反向引物、引物对和组合具有如上文所述的意思。在一个优选的实施方案中，试剂盒进一步包含多种实时定量pcr所使用的通用常规试剂。在一个优选的实施方案中，试剂盒进一步包含定量对照标准品。在一个优选的实施方案中，所述对照标准品是质粒构建体pjet1.2-hexon-e1a-e1b55k。

74、在另一方面，本发明提供了腺病毒载体制品，其特征在于，其中的rca含量利用本发明的方法检测，或使用本发明的引物探针组合和/或试剂盒检测，可确认污染的rca含量少于50(copies/μl)/腺病毒基因组浓度(copies/μl)，即相对于非复制型腺病毒制品基因组含量而言，rca含量低于50copies/μl。在一个实施方案中，非复制型腺病毒制品基因组浓度是1×1011vg/ml，因此本发明的方法能够检出相对含量为的rca，即经检测的腺病毒载体制品rca含量低于