一种全人源新冠病毒变异株强效中和抗体H4D12及应用

一种全人源新冠病毒变异株强效中和抗体h4d12及应用
技术领域
1.本发明公开了一种抗体，属于蛋白质或多肽技术领域。


背景技术：

2.新冠病毒感染（covid-19）是由新型冠状病毒（sars-cov-2）感染引起的一种新的高传染性疾病。新冠病毒不断进化，产生了大量的病毒变异株，世界卫生组织将这些变异株列为“关切变异株”（variants of concern ,vocs），包括以前流行的alpha，beta，gamma，delta变异株，以及目前流行的具有高度传染性的omicron变异株及其亚变种，在全球范围内，ba.1已经迅速被ba.2取代。ba.2和ba.4/5亚变种推动了循环sars-cov-2的进一步多样化，出现了几个额外的亚变种，包括ba.2.75、ba.2.76、ba.4.6、bq.1、bq.1.1和bf.7等。
3.sars-cov-2属于冠状病毒科的β-冠状病毒属，是一类有囊膜的单股正链rna病毒，其基因组长度约为30 kb。基因组的前2/3是非结构基因orf1a/b，主要编码与病毒复制相关的酶（rna依赖的rna聚合酶，rdrp），后1/3依次编码四种结构蛋白：刺突蛋白（s），包膜蛋白（e），膜蛋白（m）和核衣壳蛋白（n）。其中，s蛋白含有病毒受体结合区，可与人细胞表面的血管紧张素转换酶2（ace2）受体结合，介导病毒吸附和进入细胞，是病毒入侵宿主易感细胞的关键蛋白。
4.中和抗体作为极具前景的治疗药物之一，相较于小分子药物，具有作用机制明确、特异性强、灵敏度高、交叉反应少等优点，是新冠病毒治疗药物研究的重点方向。与疫苗相比，中和抗体能够给人们立即提供对正在流行的病毒株的抵抗力，而且对于那些因为身体原因无法对疫苗产生有效应答的人群（包括老年人和免疫系统有缺陷的患者）来说，中和抗体提供了一种有力的替代选择。另外，对于突破性感染的人群来说，可以选择中和抗体进行治疗。中和抗体能够通过阻断病毒颗粒与其受体结合，激活巨噬细胞、nk细胞等免疫细胞和补体等多种机制来杀伤、清除病毒颗粒以及受感染细胞，实现防治新冠病毒感染的目的。目前，有7种新冠单抗治疗药物获得紧急使用授权（如表1所示），但因变异株的出现，多株单抗的有效性受到挑战。其中再生元公司、礼来联合君实生物以及葛兰素史克公司研发的抗体药物对omicron及其亚型的有效性显著下降甚至完全失效，被美国fda取消紧急使用授权。我国获批使用的由腾盛博药公司研发的brii196和198对omicron亚型变异株的中和活性也显著降低，因而亟需研制能提供广谱保护效果的新一代中和抗体药物。
5.表1 获得紧急使用授权的新冠抗体药物
。
6.当前，中和单抗可以通过杂交瘤技术、人源化转基因小鼠、噬菌体文库筛选以及单细胞pcr技术获得。单细胞pcr技术具有全人源、天然稳定性好等优点，被广泛用于新冠中和抗体的研发。单细胞pcr技术的原理是新型冠状病毒感染恢复者或新冠疫苗接种者体内存在对抗病毒的保护性单克隆抗体，编码抗体的基因位于人体外周血单个淋巴细胞内，通过流式细胞仪分选和单细胞pcr技术可以“钓取”此基因。然后通过基因工程手段，可实现体外规模化制备此分子。
7.本发明的目的就是采用流式分选-单细胞pcr技术从重组新型冠状病毒疫苗接种者的外周血中获得具有优异广谱中和活性的单抗，提供针对covid-19具有良好保护效果的全人源单克隆抗体，以应对当前流行以及将来可能出现的变异株。


技术实现要素：

8.基于上述目的，本发明通过流式分选-单细胞pcr技术首先提供了一种抗sars-cov-2的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no:1第26-33、51-58、97-114位氨基酸序列所示；轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no:5第27-32、50-52、89-96位氨基酸序列所示。所述单克隆抗体在本发明中被命名为“h4d12”。
9.在一个优选的实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:5所示。
10.在一个更为优选的实施方案中，所述抗体的重链恒定区的氨基酸序列如seq id no:3所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no:7所示。
11.第二，本发明还提供了一种编码上述单克隆抗体重链和轻链的多核苷酸，编码所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列由seq id no:2所示，编码所述抗体的轻链可变区的多核苷酸序列由seq id no:6所示。
12.在一个优选的实施方案中，编码所述抗体的重链恒定区的多核苷酸序列由seq id no:4所示，编码所述抗体的轻链恒定区的多核苷酸序列由seq id no:8所示。
13.第三，本发明还提供了一种表达上述编码单克隆抗体重链和/或轻链的多核苷酸的功能元件，这种功能元件可以是传统的表达载体。
14.在一个优选的实施方案中，所述功能元件为线性表达框。
15.在另一个优选的实施方案中，所述功能元件为哺乳动物表达载体。
16.第四，本发明还提供了一种含有上述线性表达框的宿主细胞。
17.在一个优选的实施方案中，所述细胞为expi 293f细胞。
18.在另一个优选的实施方案中，所述细胞为cho-k1或cho-s细胞，本发明可以使用cho-k1或cho-s细胞构建工程细胞株，实现产业化生产。
19.最后，本发明还提供了上述单克隆抗体在制备covid-19治疗药物中的应用。
20.本发明提供的单克隆抗体通过流式分选-单细胞pcr技术筛选获得，具有独特的cdr分区，其抗原识别表位位于s1蛋白的rbd区。所述抗体与sars-cov-2野生型s-ecd的亲和力为0.5nm，与ba.2.75s-ecd的亲和力为0.8nm。在假病毒中和实验中，对新冠病毒野生型假病毒的ic
50
是4.9 ng/ml，中和delta假病毒的ic
50
是6.9 ng/ml，中和ba.2假病毒的ic
50
是5.8 ng/ml，中和ba.2.75假病毒的ic
50
是7.1 ng/ml，中和ba.2.76假病毒的ic
50
是6.4 ng/ml，中和ba.4假病毒的ic
50
是445.7 ng/ml，中和ba.4.6假病毒的ic
50
是320.4 ng/ml，中和bq.1假病毒的ic
50
是215.4 ng/ml，中和bq.1.1假病毒的ic
50
是209.2 ng/ml，中和bf.7假病毒的ic
50
是112.2 ng/ml，中和bj.1假病毒的ic
50
是3.8 ng/ml，显示h4d12对目前的主要变异株具有广谱高效中和活性。本发明公开的单克隆抗体具有高表达、全人源、稳定性好的特点，适合产业化生产，对于应对目前及将来可能出现的变异株导致的爆发流行具有重大临床应用价值。
附图说明
21.图1. 流式细胞仪单细胞分选图；图2. h、κ、λ三种链基因的巢式pcr扩增后毛细管电泳鉴定图；图3. 抗体表达上清与ba.4/ba.2.12.1的结合活性图；图4. 单克隆抗体h4d12可变区序列的检索结果输出图；图5. bli检测单抗h4d12与s1、rbd、ntd、s2蛋白的结合活性；图6. bli检测h4d12对wt s蛋白的亲和力；图7. bli检测h4d12对ba.2.75s蛋白的亲和力；图8. h4d12对新冠假病毒的广谱中和活性。
具体实施方式
22.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
23.实施例1.人源抗sars-cov-2单克隆抗体的筛选和制备1.血液样品的采集在获得知情同意书后，采集吸入型重组新型冠状病毒疫苗免疫者雾化免疫后一个月的血液样品20 ml，用于后续实验。
24.2. 流式分选记忆b细胞将采集的血样利用ficoll密度梯度离心法分离pbmc，过程如下：1）取新鲜抗凝全血，edta抗凝。在离心管中加入与血液样本等体积的分离液，将血
样平铺到分离液液面上方，保持两液面界面清晰。
25.2）配平，室温，水平转子800 g，加减速度3，离心30 min。离心结束后，管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆/组织匀浆层，血浆层与分离液层之间是一层薄且较致密的白膜，即单个核细胞（包括淋巴细胞和单核细胞）层。
26.3）将白膜层小心吸取到新的50 ml离心管中，用pbs稀释3倍，颠倒混匀。室温，水平转子600 g，离心10 min，弃上清。重复洗涤2 次。
27.4）用pbs将淋巴细胞重悬备用。将用来分选的细胞计数，按照下表推荐用量，先加入除anti-his tag抗体以外的所有抗体以及抗原，4℃孵育1 h，随后pbs+2% fbs清洗两次，再加入anti-histag抗体，用pbs+2% fbs补足反应体系，4℃孵育1 h。
28.表2. 流式分选荧光抗体/抗原。
29.5）使用含2% fbs的pbs重复洗涤2-3次，1 ml fpbs重悬，用40 μm细胞筛去除细胞团，4℃避光保存供分选。
30.6）使用细胞分选仪（beckman mofloxdp）分选sars-cov-2 s-ecd特异的单个记忆b细胞。分选策略为：cd3-/cd19
+
/igg
+
/cd27
+
/ba.4/ba.2.12.1/ba.2/wt s-ecd
+
，如图1，图1-a中圈出淋巴细胞，图1-b中圈出cd3-/cd19
+
的b细胞，图1-c中圈出igg
+
/cd27
+
的记忆b细胞，图1-d中圈出ba.4/ba.2.12.1/ba.2/wt s-ecd
+
的记忆b细胞。直接将单个记忆b细胞分选至96孔板中，96孔板中每孔预先加入20 μl去rna酶水和20 u rna酶抑制剂，-80℃保存。
31.3. 利用单细胞-pcr技术扩增全人源单抗可变区基因1）反转录pcr参考说明书（qiagen，210212），程序简单介绍如下：通过流式细胞仪分选了342个单细胞。向每个反应体系中同时加入以下全部的针对重链（heavy chain，h）、kappa轻链( kappa chain，κ)、lamda轻链(lamda chain，λ)各亚型的特异引物（引物序列见表3）。引物：h：5
′ꢀ
l-vh 1、5
′ꢀ
l-vh3、5
′ꢀ
l-vh 4/6，5
′
l-vh5、huigg-const-anti、3
′
cm ch1；κ：5
′ꢀ
l vκ 1/2、5
′ꢀ
l vκ 3、5
′ꢀ
l vκ 4、3
′ꢀ
cκ 543
–
566；
λ：5
′ꢀ
l vλ 1、5
′ꢀ
l vλ 2、5
′ꢀ
l vλ 3、5
′ꢀ
l vλ 4/5、5
′ꢀ
l vλ 6、5
′ꢀ
l vλ 7、5
′ꢀ
l vλ 8、3
′ꢀ
cλ。
32.表3反转录pcr引物序列。
33.pcr反应体系中包含：5
×
缓冲液6 μl、dntp 1.2 μl、反转录酶（qiagen，210212）1.2 μl、引物如上、模板为单细胞，水补齐至30 μl。pcr反应条件为：50℃反转录30 min，95℃预变性15 min，接着95℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，40个循环，最后72℃延伸10 min。
34.2）巢式pcr取反转录产物1μl为模板，进行巢式pcr反应扩增h、κ、λ的可变区，扩增重链可变区、κ轻链可变区和λ轻链可变区的引物如下表4所示。
35.表4. 巢式pcr引物序列
。
36.pcr反应体系中包含：10
×
缓冲液5 μl、10 mm dntp mix 1 μl、dna聚合酶（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，p201）0.5 μl、引物如上各0.2 μl、模板为反转录产物1 μl、水补齐至50 μl。pcr反应条件为：94 ℃预变性5 min，接着，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环，最后72 ℃延伸7 min。
37.3）毛细管电泳对巢式pcr扩增产物用qiagen dna fast analysis cartridge （qiagen，929008）进行毛细管电泳，一个单细胞中重链和轻链基因均扩增成功的克隆，被认为是配对成功的克隆。h链和κ链配对成功的共51对，h链和λ链配对成功的共37对。图2是对h、κ、λ三种链基因的巢式pcr扩增后毛细管电泳的鉴定图谱。
38.4. 线性表达框表达抗体相比传统的表达载体构建方法，构建线性表达框更为快速。设计的线性表达框含有单抗在哺乳细胞内表达的所有元件，线性表达框从5’端依次含有cmv启动子序列（genbank登记号：x03922.1）、抗体前导肽的编码序列、抗体可变区（从单细胞中扩增获得）、抗体恒定区（生工生物合成，重链恒定区序列由seq id no:3所示，dna编码序列由seqid no:4所示，kappa型轻链恒定区序列由seq id no:7所示，dna编码序列由seqid no:8所示）、多聚a尾（genbank登记号：x03896.1 ）连接起来，将该线性形式的dna转染入细胞中进行抗体表达。
39.具体过程是通过体外重叠延伸pcr技术将各个pcr片段连接构建：1）扩增启动子-前导序列以pmd-cmvh和pmd-cmvl为模板，分别扩增重链和轻链的启动子-前导序列片段。扩增重链启动子-前导序列片段的pcr反应体系中包括：模板质粒pmd-cmvh 10 ng，10
×
缓冲
液5 μl、2.5 mm dntp 4 μl、dna聚合酶 0.5 μl、引物5'-cmv-up (与cmv启动子上游序列匹配) （5'-gatatacgcgttgacattgattattgac-3'）、引物3'-leader-h(hr)（5'-acactgaacaccttttaaaattag-3', 用于重链的融合, 信号肽序列的核苷酸序列为5'-atgaacttcgggctcagcttgattttccttgtcctaattttaaaaggtgtc-3'），编码的氨基酸序列为mnfglsliflvlilkgv。扩增轻链启动子-前导序列片段的pcr反应体系中包括：模板质粒pmd-cmvl 10 ng，10
×
缓冲液5 μl、2.5 mm dntp 4 μl、dna聚合酶 0.5 μl、引物5'-cmv-up（5'-gatatacgcgttgacattgattattgac
ꢀ‑
3'）、引物3'
‑ꢀ
leader-l(hr)(5'-cccacaggtaccagatacccatag
ꢀ‑
3')，用于轻链的融合，全长信号肽序列核苷酸序列为5'-atggattcacaggcccaggttcttatgttactgctgctatgggtatctggtacctgtggg-3'，氨基酸序列为mdsqaqvlmllllwvsgtcg，信号肽序列来源鼠源单抗可变区）、水补齐至50 μl。
40.pcr反应条件：95 ℃预变性10 min，接着95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。
41.2）扩增抗体恒定区-多聚a尾片段h链恒定区-多聚a尾片段pcr体系中包含：模板质粒pmd-tkh 10 ng、10
×
缓冲液5 μl、2.5 mm dntp 4 μl、dna聚合酶 0.5 μl、引物5'-ch （5'-accaagggcccatcggtcttcccc-3'）、引物3'-tk-poly(a) （5'-aagtgtagcggtcacgctgcgcgtaacc
ꢀ‑
3'）、水补齐至50 μl。
42.κ链恒定区-多聚a尾片段pcr体系中包含：模板质粒pmd-tkκ 10 ng、10
×
缓冲液5 μl、2.5 mm dntp 4 μl、dna聚合酶 0.5 μl、引物5'-cκ （5'-actgtggctgcaccatctgtcttc-3'）、引物3'-tk-poly(a) （5'-aagtgtagcggtcacgctgcgcgtaacc
ꢀ‑
3'）、水补齐至50 μl。
43.λ链恒定区-多聚a尾片段pcr体系中包含：模板质粒pmd-tkλ 10 ng、10
×
缓冲液5 μl、2.5 mm dntp 4 μl、dna聚合酶 0.5 μl、引物5'-cλ （ctacgtcagcccaaggctgccccc）、引物3'-tk-poly(a) （5'-aagtgtagcggtcacgctgcgcgtaacc
ꢀ‑
3'）、水补齐至50 μl。
44.pcr反应条件为：95℃预变性10 min，接着95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。
45.3）扩增抗体可变区取巢式pcr产物1μl为模板，使用vazyme taq plusdna polymerase并按照产品说明书，分别使用对应的混合引物对抗体的h链、κ链、λ链进行扩增，对应引物如下表5所示。
46.表5. pcr引物序列
。
47.※
单独划线部分用于与上游片段融合，划线黑体部分用于与下游片段的融合。
48.pcr反应体系中包含：10
×
缓冲液5 μl、10 mm dntp mix 1 μl、dna聚合酶（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，p201）0.5 μl、引物如上各0.2 μl、模板为巢式pcr产物1 μl、水补齐至50 μl。pcr反应条件为：94 ℃预变性5 min，接着，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环，最后72 ℃延伸7 min。
49.4）分别扩增重链和轻链的线性表达框pcr反应体系中包括：模板：纯化后的启动子-前导序列片段10 ng、重链/轻链可变区片段10 ng、重链/轻链恒定区-多聚a尾片段10 ng，10
×
缓冲液5 μl、10 mm dntp mix 1μl、dna聚合酶（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，p201）0.5 μl、引物5'-cmv-up （5'-gatatacgcgttgacattgattattgac
ꢀ‑
3'）和3'-tk-poly(a) （5'-aagtgtagcggtcacgctgcgcgtaacc
ꢀ‑
3'、水补齐至50 μl。
50.pcr反应条件为：95℃预变性10 min，接着95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 3 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。
51.5）pcr产物回收纯化和定量pcr反应产物直接用omega公司回收试剂盒回收。dna定量：用nano（ge healthcare）对pcr回收产物进行定量。
52.6）细胞共转染：将293t细胞以2
×
105/ml接种于96孔细胞培养板中，在含有5% co2的细胞温箱中，37℃培养过夜。次日，96孔板每孔加入20 μl无血清的opti-mem培养基中，构建成功的重链和轻链线性表达框pcr产物各0.1 μg，混匀后加入0.4 μl转染试剂turbofect（thermo scientific, r0531），共同孵育15-20 min后逐滴加至过夜培养的293t细胞培养孔中。在含有5% co2的细胞温箱中，37℃培养48 h后收细胞培养上清备用。
53.5. elisa筛选具有结合活性的抗体1）包被：实验前一天96孔酶联板，取重组的sars-cov-2 s-ecd抗原及羊抗人igg（h&l）抗体（abcam，ab97221）用包被液稀释至浓度2 μg/ml，包被酶标板，每孔100 μl，4℃包被过夜。
54.2）封闭：实验当天用洗板机（bio-tek，405_ls）洗3次，每孔加入100
ꢀµ
l封闭液，37℃ 孵育1小时。
55.3）样品孵育：洗板3次，加入50
ꢀµ
l的转染细胞培养上清和50
ꢀµ
l稀释液，37℃ 孵育1小时。
56.4）二抗孵育：洗板3次，将hpr标记的羊抗人igg二抗（abcam，ab97225）以1:10000用稀释液进行稀释，每孔100
ꢀµ
l加入到elisa板对应孔中，37℃ 孵育1小时。
57.5）显色：洗板3次，每孔加入100
ꢀµ
l的tmb单组份显色液，显色6 min，室温避光，之后每孔加入50
ꢀµ
l终止液终止反应。用酶标仪上检测450-630nm处的od值，以未加待测样品的孔为阴性对照，od
450-630
＞阴性对照2.1倍以上的孔为阳性。
58.6.表达载体的构建及单抗制备构建轻、重链重组表达质粒，进行单抗的表达制备。
59.1）pcdna3.4-h4d12-h表达质粒构建：以线性表达框为模板，扩增重链，切胶回收1.4kb大小的重链片段，表达载体pcdna3.4（thermofisher scientific，a14697）使用ecori/bamh i酶切后回收，将重链和载体片段通过同源重组（nebuilder hifi dna assembly master mix, e2621l）方法进行连接，转化top10挑取克隆进行测序鉴定，构建成功重链的表达载体pcdna3.4-h4d12-h。
60.2）pcdna3.4-h4d12-κ表达质粒构建：以轻链表达框为模板，扩增轻链，胶回收约0.7kb的轻链片段，将轻链和载体片段通过同源重组方法连接，转化top10挑取克隆进行测序鉴定，构建成功轻链的表达载体pcdna3.4-h4d12-κ。
61.3）单抗的瞬时表达和亲和层析纯化使用expi293 表达系统，取15 μg重链和15 μg轻链混合后转染expi 293f细胞，按照说明书进行操作（thermofisher scientific，a14635），5-6天后收获培养液，离心后上清约30 ml，使用体积为5 ml的预装protein a亲和层析柱，上样前使用20 mm pbs平衡，待电导显示到基线后进样，上样结束后，使用20 mm pbs洗涤色谱柱至基线平稳，使用0.1 m ph 3.0的甘氨酸缓冲液洗脱目的蛋白，待od
280
近基线后，停止收集，使用至少3个柱体积的20 mm的pbs洗涤色谱柱，至基线平稳后，用20%的乙醇洗涤色谱柱。
62.结果：将88株重链和轻链基因配对的单抗进行线性表达框表达，并分析单抗的表达量和对ba.4或ba.2.12.1 s-ecd蛋白的结合活性。图3结果显示有18株单抗与ba.4或ba.2.12.1 s-ecd能够特异性结合。构建18株具有结合活性的单抗重链和轻链基因至pcdna3.4载体中，并表达纯化单抗，低温保存用于后续活性鉴定。
63.7．序列分析对筛选获得的克隆h4d12的pcr扩增物的dna序列测定和分析，登录imgt网站（http://www.imgt.org/imgt_vquest/analysis）进行可变区检索，为典型的抗体序列，符合预期。检索结果如图4所示，图4-a显示单抗h4d12重链可变区的检索结果，v区同源性最高为89.93%，j区同源性最高为92.00%，d区使用读框2。图4-b显示单抗h4d12轻链的检索结果，v区同源性最高为93.91%，j区同源性最高为97.30%。对单抗h4d12的序列进行分析，重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示，重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no:1第26-33、51-58、97-114位氨基酸序列所示，编码重链可变区的多核苷酸序列由seq id no:2所示；轻链可变区的氨基酸序列如seq id no: 5所示，轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3区的氨基酸序列分别如seq id no:5第27-32、50-52、89-96位氨基酸序列所示，编码轻链可变区的多核苷酸序列由seqid no:6所示。
64.实施例2. 抗体h4d12识别表位分析1. 配置缓冲液：running buffer（pbs+0.02%tween 20+0.2%bsa），regeneration buffer（10 mm gly，ph1.75）。
65.2. 样品准备：用running buffer将抗体稀释至50 nm（7.5 μg/ml），根据抗原蛋白的分子量将其分别稀释至200 nm，吸取250 μl加入96孔板对应位置中。样品所在板为a板，按照设计布局加入对应样品后置于倾斜板架上。
66.3. 打开gator仪器，点开数据采集软件，待仪器完成自检后选择程序模块。用镊子将hfc探针小心从盒中取出，浸泡到已加入200 μl缓冲液的96孔板中，注意探针针头不要碰到板壁。将96孔板放于水平板架上，探针所在板为b板。
67.4. 选择k assay程序进行样品检测：在主界面assay setup中选择k assay，basic parameters中equilibration setting设置time为600 s，shaker a speed为400 rpm，shaker b speed为1000 rpm；plate set up中按照baseline
ꢀ–ꢀ
loading
ꢀ–ꢀ
baseline
ꢀ–ꢀ
association
ꢀ–ꢀ
dissociation的实验方案选择样品类型，输入96孔板中样品信息，包括样品名称和浓度；assaysteps中定义每个步骤的position，time，speed和step type，step 1为baseline，time为60 s，speed为1000 rpm，step 2为loading，time为100 s，speed为400 rpm，step 3为baseline，time为60 s，speed为1000 rpm，step 4为association，time为300 s，speed为1000 rpm，step 5为dissociation，time为300 s，speed为1000 rpm；preview中点击start开始运行程序。
68.5. 结果分析：运行结果在主界面results&analysis模块中，点击new k analysis，在experiment selection中选择要分析的实验；以association的起点对齐各结果曲线，点击processed显示对齐后的数据，导出结果数据及图像，根据结果图像判断抗体结合表位。
69.结果：检测h4d12与不同抗原表位的结合活性，具体见图5，h4d12与sars-cov-2的s1和rbd蛋白均特异结合，而与ntd蛋白和s2蛋白均不结合。结果表明，单抗h4d12识别的表位位于s1蛋白的rbd区。
70.实施例3：抗体h4d12的亲和力鉴定1. 配置缓冲液：running buffer（pbs+0.02%tween 20+0.2%bsa），regeneration buffer（10 mm gly，ph1.75）。
71.2.样品准备：用running buffer将抗体稀释至50 nm（7.5 μg/ml），将抗原稀释至200 nm、100 nm、50 nm、25 nm、12.5 nm、6.25 nm，分别吸取250 μl加入96孔板对应位置中。样品所在板为a板，按照设计布局加入对应样品后置于倾斜板架上。
72.3. 打开gator仪器，点开数据采集软件，待仪器完成自检后选择程序模块。用镊子将hfc探针小心从盒中取出，浸泡到已加入200 μl缓冲液的96孔板中。将96孔板放于水平板架上，探针所在板为b板。
73.4. 选择k assay程序进行样品检测：在主界面assay setup中选择k assay，basic parameters中equilibration setting设置time为600 s，shaker a speed为400 rpm，shaker b speed为1000 rpm；plate set up中按照baseline
ꢀ–ꢀ
loading
ꢀ–ꢀ
baseline
ꢀ–ꢀ
association
ꢀ–ꢀ
dissociation的实验方案选择样品类型，输入96孔板中样品信息，包括样品名称和浓度；assaysteps中定义每个步骤的position，time，speed和step type，step 1为baseline，time为60 s，speed为1000 rpm，step 2为loading，time为100 s，speed为400 rpm，step 3为baseline，time为60 s，speed为1000 rpm，step 4为association，time为300 s，speed为1000 rpm，step 5为dissociation，time为300 s，speed为1000 rpm；preview中
点击start开始运行程序。
74.5. 结果分析：运行结果在主界面results&analysis模块中，点击new k analysis，在experiment selection中选择要分析的实验；在reference中设置ref.probe来定义实验中的对照探针，选中非对照孔，点击edit formula，选择多减多运算模式，将参照减去后，点击processed显示处理后的数据；在binding fitting中，parameters中fitting选择global，点击binding curvefit来计算拟合曲线；在kinetic analysis中，选择binding fitting graph后，点击calculate kinetics，计算并显示单抗h4d12与不同抗原的结合动力学数据ka、kd、kd。
75.结果：图6-图7分别是h4d12与wt（野生型，genbank编号：nc_045512.2）、ba.2.75的s-ecd的亲和力常数测定图，结果显示其对wt的亲和力常数kd为0.5nm，对ba.2.75的亲和力常数kd为0.8nm，测量的r2值均为97%以上。结果显示该中和抗体与sars-cov-2的野生型及omicron亚变种的s抗原均具有很好的亲和力，使其发展成新冠病毒感染特效药成为可能。
76.表6. 单抗h4d12与不同抗原的结合动力学数据。
77.实施例4. 抗体h4d12的假病毒中和活性鉴定1. 将纯化单抗用培养基 dmem+10% fbs 自初始浓度3倍系列稀释，加入96孔培养板，设置3个复孔，体积50 μl/孔；随即每孔加入50 μl新冠病毒野生型或突变株的假病毒悬液（用dmem+10% fbs稀释病毒至合适滴度），充分混匀，另设置存活对照（不加病毒和抗体）和死亡对照（只加病毒），置37℃ 5% co2细胞培养箱孵育 1 h。
78.2. 将hek293t细胞用0.25%的胰酶消化后，用培养基（dmem+10% fbs）稀释至2.5
×
105cells/ml 浓度，接种到 96 孔细胞培养板中，接种体积 100 μl/孔，置 37℃ 5% co2细胞培养箱培养过夜。
79.3. 48 h后弃100 μl细胞培养上清，加入100 μl显色底物，避光孵育2 min。吸取150 μl转移到96孔白色微孔板，利用tecan spark多功能微孔板检测仪读取luciferase信号值；用[1
‑ꢀ
(样本-存活对照组信号) / (死亡对照组信号-存活对照组信号)]
×ꢀ
100%计算抗体中和率，用 graphpad prism 8 拟合曲线，计算抗体ic
50
值。
[0080]
结果：见图8，单抗h4d12对新冠病毒野生型假病毒的ic
50
是4.9ng/ml，中和delta假病毒的ic
50
是6.9 ng/ml，中和ba.2假病毒的ic
50
是5.8 ng/ml，中和ba.2.75假病毒的ic
50
是7.1 ng/ml，中和ba.2.76假病毒的ic
50
是6.4ng/ml，中和ba.4假病毒的ic
50
是445.7 ng/ml，中和ba.4.6假病毒的ic
50
是320.4 ng/ml，中和bq.1假病毒的ic
50
是215.4 ng/ml，中和bq.1.1假病毒的ic
50
是209.2 ng/ml，中和bf.7假病毒的ic
50
是112.2 ng/ml，中和bj.1假病毒的ic
50
是3.8 ng/ml。结果显示h4d12对令人关注的主要变异株的假病毒具有广谱高效中和活性。