生产透明质酸的重组细胞的制作方法

本发明涉及透明质酸的生物生产领域。

背景技术：

1、透明质酸也称为玻尿酸或ha，是一种天然存在的高分子量多糖，由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰-d-葡萄糖胺经由交替的β-(1→4)和β-(1→3)糖苷键连接组成并具有化学式(c14h21no11)n。透明质酸的长度可以是25,000个二糖重复单元。透明质酸的聚合物在体内的尺寸范围可以为5,000至20,000,000da。

2、ha在医疗和美容领域有许多应用，包括用于组织工程化的支架、皮肤病学填充剂和用于骨关节炎治疗的粘稠补充剂。具体地，经由降解或合成减慢而导致ha质量或分子量减少影响物理和化学特性，例如组织体积、粘度和弹性。因此，对ha生产的需求一直存在。

3、目前已知的ha主要来源是人脐带、鸡冠和某些微生物的发酵物。

4、用于从微生物体制备ha的发酵方法特别令人感兴趣，因为它们有利于通过可能的规模化、以降低的成本生产大量ha。与从提供非常高分子量的透明质酸的动物源中分离ha相反，微生物发酵可以在一定程度上控制起始分子量的大小。这避免了通过机械、物理或化学手段进行进一步分级分离步骤的需要。

5、为此，例如a组和c组溶血性链球菌的细菌培养物已被证明是代表良好的ha来源(us5316926、us4801539、jp2009011315)。然而，此类细菌并且特别是本领域主要使用的兽疫链球菌(streptococcus zooepidemicus)，通常不被认为是安全的。重组芽孢杆菌属(bacillus)宿主细胞还显示出产生20至800kda范围内的ha的能力(us2008038780)。us2006168690中也已证明，转化植物细胞以包含编码透明质酸合酶的dna可使得成功地产生ha。最后，小分子ha的产生也已在酵母中得到证实，例如在cn104263666中的重组巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)中。

6、与通常用于生产生物分子的其他微生物相反，酵母通常被认为是安全的。与细菌相比，它们可以快速生长并以更高的密度培养，并且不需要无菌环境。此外，酵母细胞比细菌更容易从培养基中分离，大大简化了产品提取和纯化的工艺。最后，酵母具有对培养基中ph变化具有更强耐受性的优势，并因此代表了更强的发酵系统。

7、然而，在酵母中，物种之间的区分特征也可能带来一定的挑战。这主要是由于物种之间新陈代谢的差异造成的。例如，巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)中的基因组整合是稳定的，但通常会遇到来自一次转化的克隆的高度变异性，显示出各种生产力特征或生理学变化。这需要耗时的筛选过程，以便找到具有所想要应用的最佳特征的克隆。这种克隆变异性是巴斯德毕赤酵母作为用于生产增值化学品平台进一步发展的一个重要缺点。使用巴斯德毕赤酵母的另一个缺点是它是一种嗜甲烷菌生物体。

8、相反，酿酒酵母作为生产目标分子的工具特别有用，因为它在被人使用(例如在葡萄酒、啤酒或面包中)方面具有悠久的安全史，并因此是一种完善建立的模型，其遗传信息是本领域众所周知的。酿酒酵母还具有被普遍认为对人和动物安全的优势。更重要的是，培养这种酵母时发生的培养基酸化降低了生物发酵罐污染的可能性，并因此无需向培养基中添加抗生素。最后，许多遗传工具已被开发出来，允许对其基因组进行稳定修饰(在染色体内整合)。

9、因此，本领域仍然需要允许透明质酸高效合成和分泌的另外的透明质酸生产方法。特别地，仍然需要提供具有成本效益的生产方法并提供对人应用安全的透明质酸。

10、在具体情况下，本领域仍然需要能够获得大量特定且受控尺寸的透明质酸的透明质酸方法。

技术实现思路

1、本发明因此涉及以下各项：

2、项1：一种生产透明质酸(ha)的重组酵母细胞，其中所述重组细胞包含：

3、(a)编码具有透明质酸(hyaluronan)合酶活性的多肽的一种或多种重组核酸；

4、(b)编码具有udp-葡萄糖脱氢酶(udp-glcdh或hasb)活性的多肽的一种或多种重组核酸；

5、(c)编码具有透明质酸酶活性的多肽的一种或多种重组核酸，其中所述具有透明质酸酶活性的多肽包含分泌信号，使得透明质酸、特别是具有所想要分子量的透明质酸(hamw)由重组酵母细胞生产，和

6、(d)(i)编码具有谷氨酰胺合成酶(gln1)活性的多肽的一种或多种重组核酸；和/或

7、(ii)编码谷氨酸合酶(glt1)的一种或多种破坏的内源核酸；

8、其中所述重组酵母细胞属于酵母属(saccharomyces)，或属于念珠菌属(candida)，或属于克鲁维酵母菌属(kluyveromyces)，或属于汉逊酵母属(ogataea)，或属于耶氏酵母属(yarrowia)，或属于德巴利酵母属(debaryomyces)，或属于阿舒囊霉属(ashbya)。

9、如实例中所示，本发明的重组酵母允许在天然不能产生透明质酸的酵母细胞中生产透明质酸。实例进一步证明，重组酵母生产的透明质酸的大小是可控制的。

10、所述有利特性可以通过将酵母与下文所述的额外修饰重组来进一步增强。

11、项2：一种生产透明质酸(ha)的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含：

12、(a)编码具有透明质酸合酶(hyaluronan synthase)活性的多肽的一种或多种重组核酸；

13、(b)编码具有udp-葡萄糖脱氢酶(udp-glcdh或hasb)活性的多肽的一种或多种重组核酸；

14、(c)编码具有透明质酸酶活性的多肽的一种或多种重组核酸，其中所述具有透明质酸酶活性的多肽包含分泌信号和锚定信号，使得透明质酸、特别是具有所想要分子量的透明质酸(hamw)由宿主细胞生产；和

15、(d)(i)编码具有谷氨酰胺合成酶(gln1)活性的多肽的一种或多种重组核酸；和/或

16、(ii)编码谷氨酸合酶(glt1)的一种或多种破坏的内源核酸。

17、项3：根据项1或2所述的重组细胞，其中所述ha的分子量在小于50kda的范围内，优选在约20kda至约50kda的范围内。

18、项4：根据项1或2所述的重组细胞，其中所述ha的分子量在大于50kda的范围内，优选在约50kda至约250kda的范围内。

19、项5：根据项1或2所述的重组细胞，其中所述ha的分子量在大于100kda的范围内，优选在约100kda至约1500kda的范围内。

20、项6：根据项1至5中任一项所述的重组细胞，其中编码具有谷氨酰胺合成酶活性的多肽的核酸获自或源自酿酒酵母。

21、项7：根据项1至6中任一项所述的重组细胞，其中编码具有透明质酸酶活性的多肽的核酸获自或源自以下中的至少一者：萨氏九杯蛛(cupiennius salei)、居中平甲蛛(loxosceles intermedia)、日本医蛭(hirudo nipponia)、大具窍蝮蛇(bothrops atrox)或巴西钳蝎(tityus serrulatus)。

22、项8：根据项1至7中任一项所述的重组细胞，其中编码具有透明质酸合酶活性的多肽的核酸获自或源自以下中的至少一者：兽瘟链球菌、小球藻属病毒(chlorella virus)pbcv1、小球藻属病毒cvikl、小球藻属病毒il-5-2s1、小球藻属病毒cz-2、小球藻属病毒cvg-1、非洲爪蟾或多杀巴斯德菌(pasteurella multocida)，并且特别获自或源自以下中的至少一者：兽瘟链球菌、小球藻属病毒pbcv1、小球藻属病毒cvikl、小球藻属病毒il-5-2s1、小球藻属病毒cz-2、小球藻属病毒cvg-1或非洲爪蟾。

23、项9：根据项1至8中任一项所述的重组细胞，其中编码具有udp-葡萄糖脱氢酶活性的多肽的核酸获自并且源自以下中的至少一者：拟南芥(arabidopsis thaliana)、小球藻属病毒pbcv1或兽瘟链球菌，并且特别源自拟南芥或小球藻属病毒pbcv1。

24、项10：根据项1至9中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞包含编码以下中的一者或多者的重组核酸：

25、(i)具有谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺转移酶(gfa1)活性的多肽；和/或

26、(ii)具有udp-n-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶(qri1)活性的多肽。

27、项11：根据项1至10中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞包含至少一种编码以下中的一者或多者的重组核酸：

28、(i)具有磷酸葡萄糖变位酶-1(pgm1)活性的多肽；和/或

29、(ii)具有utp-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(ugp1)活性的多肽；和/或

30、(iii)具有葡萄糖胺-6-磷酸n-乙酰转移酶(gna1)活性的多肽；和/或

31、(iv)具有磷酸乙酰葡萄糖胺变位酶(pcm1)活性的多肽。

32、项12：根据项1和3至11中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述重组酵母细胞选自由以下组成的组：酿酒酵母、布拉氏酵母、贝酵母、奇异酵母、米卡酵母、卡氏酵母、白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、多孢克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母、多形汉逊酵母、解脂耶氏酵母、汉逊德巴利酵母和棉阿舒囊霉，并且优选酿酒酵母。

33、项13：根据项2至11中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞属于酵母菌目，特别是酵母菌科，并且特别选自由以下组成的组：酿酒酵母、布拉氏酵母、贝酵母、奇异酵母、米卡酵母、卡氏酵母、白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、多孢克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母、多形汉逊酵母、解脂耶氏酵母、汉逊德巴利酵母和棉阿舒囊霉，并且优选酿酒酵母。

34、项14：一种生产具有所想要分子量的透明质酸(ha)(hamw)的方法，其包括：

35、(a)在培养基中培养如项1至13中任一项所定义的重组细胞持续足以生产具有所想要分子量的透明质酸(ha)的时间；和

36、(b)任选地从所述重组细胞和/或从所述培养基分离或回收所述透明质酸(ha)。

37、项15：根据项14所述的方法，其中所述ha的分子量为约20kda至约50kda，并且优选约20kda至约30kda。

38、项16：根据项15所述的方法，其中所述ha的分子量为约30kda至约50kda。

39、项17：根据项14所述的方法，其中所述ha的分子量为约50kda至约150kda。

40、项18：根据项14所述的方法，其中所述ha的分子量为约150kda至约1500kda。

41、项19：根据项14至18中任一项所述的方法，其中所述重组细胞包含编码以下中的一者或多者的至少一种重组核酸：

42、(i)具有谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺转移酶(gfa1)活性的多肽；和/或

43、(ii)具有udp-n-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶(qri1)活性的多肽。

44、项20：根据项14至19中任一项所述的方法，其中所述重组细胞包含编码以下中的一者或多者的至少一种重组核酸：

45、(i)具有磷酸葡萄糖变位酶-1(pgm1)活性的多肽；

46、(ii)具有utp-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(ugp1)活性的多肽；

47、(iii)具有葡萄糖胺-6-磷酸n-乙酰转移酶(gna1)活性的多肽；和/或

48、(iv)具有磷酸乙酰葡萄糖胺变位酶(pcm1)活性的多肽。

49、项21：根据项14至20中任一项所述的方法，其中所述重组细胞是酵母属的成员，并且特别是酿酒酵母。

50、项22：根据项14至21中任一项所述的方法，其中所述足以生产具有所想要分子量的透明质酸(ha)的时间是约35小时至约50小时、优选约40小时至约50小时、优选约48小时的时间段。

51、项23：根据项14至22中任一项所述的方法，其中所述透明质酸的分子量通过调节所述培养基的ph来控制。

52、项24：根据项14至23中任一项所述的方法，其中所述方法以工业规模进行，优选地其中所述培养基是至少约100l，更优选地在约1000l至约3000l的范围内，甚至更优选约10,000l、甚至更优选约100,000l，或甚至约250,000l。

53、项25：一种透明质酸(ha)，其是从如项1至10中任一项所述的重组细胞可获得的或可从根据项14至24中任一项所述的方法可获得的。

54、项26：一种培养基，其包含根据项25所述的ha。

55、项27：一种组合物，其包含根据项24所述的透明质酸(ha)。

56、项28：一种工业产品或消费产品或消费品，其包含(i)根据项25所述的ha，(ii)如项26所述的培养基，或(iii)如项27所述的组合物。

57、项29：如项27所述的工业产品或消费产品或消费品，其中所述工业产品或消费产品或消费品是美容品、调味品、香料产品、食品、食物、饮料、食品定形剂、药物组合物、膳食补充剂、营养制品、清洁产品和/或牙科和/或口腔卫生组合物。

58、项30：如项1至13中任一项所定义的重组细胞用于生产具有约20kda至约50kda或约50kda至约1000kda范围内的分子量的透明质酸(ha)的用途。

59、项31：一种用于生产透明质酸的方法，其包括以下步骤：

60、(a)在培养基中培养如项1和3至12中任一项所定义的重组酵母；和

61、(b)从所述培养基回收透明质酸，

62、其中步骤(b)中回收的所述透明质酸具有通过选择以下而控制的分子量：

63、-所述重组酵母的编码透明质酸酶的核酸的性质和来源，

64、-控制所述重组酵母的编码一种或多种透明质酸酶的核酸的表达的启动子的性质和来源，

65、-所述重组酵母的与所编码的一种或多种透明质酸酶相关的锚定信号和/或分泌信号的存在，

66、-培养重组酵母的步骤期间的培养基的ph，和/或

67、-培养所述重组酵母的持续时间。

68、本发明的某些实施方式可以提供以下优点中的一者或多者：

69、·一种用于生产具有受控分子量的透明质酸的方法；

70、·一种在酿酒酵母细胞中生产具有受控分子量的透明质酸的方法；和

71、·一种用于通过改变遗传参数(例如调控序列)和/或方法参数(ph或发酵时间)来生产具有受控分子量的透明质酸的方法。

72、与本发明的任一具体的一个或多个所述方面相关的细节、实施例和优选项将在本文中进一步描述，并且同样适用于本发明的所有方面。本文所描述的实施方式、实施例和优选项的任何组合以其所有可能的变化形式均由本发明涵盖，除非本文另外指出，或者与上下文明显矛盾。