亚细胞分辨率的时空分辨转录组学的制作方法

背景技术：

1、经调控的基因表达流塑造了最基本的生命过程，并且影响许多疾病和病症的发展和进展。这些高度受控的过程包括转录、rna加工、翻译、以及信使rna(mrna)和蛋白质的降解。空间转录组学方法的发展通过在空间背景下保留遗传信息，使细胞组织和组织结构直接可视化，创造了单细胞测序技术的快速范式转变。然而，当前的空间转录组学方法仅将mrna作为转录组的静态图片来检测，掩盖了它们高度动态的性质。此外，当前大多数方法侧重于全细胞水平，确定异质细胞类型并将其映射回组织，但忽略了细胞内环境中的丰富信息。因此，需要将空间转录组学与时间维度联系起来的方法来研究空间环境中基因表达随时间的变化，并了解时空基因表达与细胞发育以及各种疾病和病症的发展和进展之间的联系。

技术实现思路

1、本公开描述了用于分析一个细胞或多个细胞(包括例如组织中存在的细胞)中的时空基因表达的方法。一方面，描述了本文称为“tempomap”(时间分辨原位测序和映射)的方法。tempomap方法以亚细胞分辨率分辨新生转录的rna，并且可通过将时间分辨纳入空间转录组工作流程来追踪基因表达(即转录组)的动态。该方法提供亚细胞水平上基于图像的单细胞描述，可用于研究细胞内活动，如表观转录组加工、mrna运输、局部翻译、rna翻译的动力学参数等。tempomap还可用于研究完整组织，并了解和鉴定与基因表达改变相关的各种疾病和病症的发展和进展的原因。本文描述的方法有助于理解rna、蛋白质及其相互作用，为可视化基因组信息在时间和空间上的处理方式提供了有价值的工具。这些方法中的任一种也可以在体内进行，如本文进一步描述的。

2、因此，一方面，本公开提供了用于分析细胞中时空基因表达的方法，包括以下步骤：

3、a)在核苷类似物库的存在下将细胞孵育达时间量t1以对由所述细胞合成的核酸进行代谢性标记，其中核苷类似物库中的每个核苷类似物包含反应性化学部分；

4、b)使代谢性标记的核酸与第一寡核苷酸探针群体接触，其中第一寡核苷酸探针群体中的每个第一寡核苷酸探针包含与核苷类似物的反应性化学部分反应的化学部分；

5、c)使代谢性标记的核酸与一个或多个包含第二寡核苷酸探针和第三寡核苷酸探针的寡核苷酸探针对接触，其中：

6、i)第二寡核苷酸探针包含条形码序列和与代谢性标记的感兴趣的核酸互补的部分；和

7、ii)第三寡核苷酸探针包含与代谢性标记的感兴趣的核酸互补的部分、第一条形码序列、与第一寡核苷酸探针群体中的第一寡核苷酸探针互补的部分、以及第二条形码序列，其中第三寡核苷酸探针的第一条形码序列与第二寡核苷酸探针的条形码序列互补；

8、d)将第三寡核苷酸探针的5’末端和3’末端连接在一起，以产生环状寡核苷酸；

9、e)使用第二寡核苷酸探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，从而产生一个或多个串联的扩增子；

10、f)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；

11、g)使嵌入聚合物基质中的一个或多个串联的扩增子与包含与第三寡核苷酸探针的第二条形码序列互补的序列的第四寡核苷酸探针接触；和

12、h)对第四寡核苷酸探针进行成像以确定嵌入聚合物基质中的一个或多个串联的扩增子的位置。

13、在一些实施方案中，步骤(a)-(h)被执行一次或多次。在一些实施方案中，在步骤(a)的孵育中使用不同的时间量t2将步骤(a)-(h)重复至少一次。在某些实施方案中，步骤(a)-(h)任选地被重复达第三时间量t3，任选地被重复达第四时间量t4，任选地被重复达第五时间量t5，任选地被重复达第六时间量t6，任选地被重复达第七时间量t7，任选地被重复达第八时间量t8，任选地被重复达第九时间量t9，并且任选地被重复达第十时间量t10。

14、在一些实施方案中，本文公开的任何方法可用于诊断和/或治疗疾病或病症。在一些实施方案中，本文公开的任何方法可用于研究rna翻译的动力学参数。在一些实施方案中，本文描述的任何方法可用于研究转录后rna修饰。在一些实施方案中，本文公开的任何方法可用于研究细胞周期和细胞复制的各个阶段的时空基因表达。

15、另一方面，本公开提供了用于分析转录后修饰在时空基因表达中的作用的方法。在一些实施方案中，本文描述的用于分析时空基因表达的方法可以在包含参与一种或多种感兴趣的核酸(例如，一种或多种rna转录物)的转录后修饰的基因的敲低的细胞中进行。然后可以将敲低细胞中各种感兴趣的核酸的时空表达与野生型细胞中相同的感兴趣的核酸的时空表达进行比较。感兴趣的核酸的表达相对于野生型细胞中的表达的任何改变可以表明转录后修饰参与调节感兴趣的核酸的时空表达。

16、另一方面，本公开提供了用于研究时空基因表达在疾病或病症的发展或进展中的作用的方法。例如，本文所述的用于分析时空基因表达的方法可以在来自患病组织(例如，取自受试者的患病组织)的细胞中进行。然后可以将来自患病组织的细胞中各种感兴趣的核酸的时空表达与来自非患病组织的细胞中相同的感兴趣的核酸的时空表达进行比较。感兴趣的核酸的表达相对于非患病细胞中的表达的任何改变可以表明感兴趣的核酸的时空表达可能参与疾病或病症的发展或进展。

17、另一方面，本公开提供了筛选能够调节一种感兴趣的核酸或多种感兴趣的核酸的时空基因表达的药剂的方法。例如，本文所述的分析时空基因表达的方法可以在一种或多种候选药剂存在下在细胞(例如，正常细胞或患病细胞)中进行。然后可以将细胞中各种感兴趣的核酸的时空表达与未暴露于一种或多种候选药剂的细胞中的相同的感兴趣的核酸的时空表达进行比较。相对于未暴露于候选药剂的细胞中的表达，感兴趣的核酸的表达的任何改变都可能表明感兴趣的核酸的时空表达受到候选药剂的调节。

18、在另一方面，本公开提供了用于诊断受试者的疾病或病症的方法。例如，本文所述的分析时空基因表达的方法可以在来自取自受试者(例如，被认为患有疾病或病症或处于患有疾病或病症的风险的受试者)的样品的细胞中进行。然后可以将细胞中各种感兴趣的核酸的时空表达与来自非患病组织样品的细胞中的相同的感兴趣的核酸的时空表达进行比较。感兴趣的核酸的表达相对于非患病细胞中的表达的任何改变都可以表明受试者患有疾病或病症。

19、在另一方面，本公开提供了用于治疗受试者的疾病或病症的方法。例如，本文所述的分析时空基因表达的方法可以在来自取自受试者(例如，被认为患有疾病或病症或处于患有疾病或病症的风险的受试者)的样品的细胞中进行。然后可以将细胞中各种感兴趣的核酸的时空表达与来自非患病组织样品的细胞中的相同的感兴趣的核酸的时空表达进行比较。如果观察到感兴趣的核酸的表达相对于非患病细胞中的表达有任何改变，则可以对受试者施用疾病或病症的治疗。

20、另一方面，本公开提供了用于分析受试者体内时空基因表达的方法，包括以下步骤：

21、a)向受试者体内施用核苷类似物库达时间量t1，以对由受试者的一个或多个细胞合成的核酸进行代谢性标记，其中核苷类似物库中的每个核苷类似物包含反应性化学部分；

22、b)从受试者收获组织样品；

23、c)使收获的组织样品中的代谢性标记的核酸与第一寡核苷酸探针群体接触，其中第一寡核苷酸探针群体中的每个第一寡核苷酸探针包含与核苷类似物的反应性化学部分反应的化学部分；

24、d)使代谢性标记的核酸与一个或多个包含第二寡核苷酸探针和第三寡核苷酸探针的寡核苷酸探针对接触，其中：

25、i)第二寡核苷酸探针包含条形码序列和与代谢性标记的感兴趣的核酸互补的部分；和

26、ii)第三寡核苷酸探针包含与代谢性标记的感兴趣的核酸互补的部分、第一条形码序列、与第一寡核苷酸探针群体中的第一寡核苷酸探针互补的部分、以及第二条形码序列，其中第三寡核苷酸探针的第一条形码序列与第二寡核苷酸探针的条形码序列互补；

27、e)将第三寡核苷酸探针的5’末端和3’末端连接在一起，以产生环状寡核苷酸；

28、f)使用第二寡核苷酸探针作为引物进行滚环扩增以扩增环状寡核苷酸，从而产生一个或多个串联的扩增子；

29、g)将一个或多个串联的扩增子嵌入聚合物基质中；

30、h)使嵌入聚合物基质中的一个或多个串联的扩增子与包含与第三寡核苷酸探针的第二条形码序列互补的序列的第四寡核苷酸探针接触；和

31、i)对第四寡核苷酸探针进行成像以确定嵌入聚合物基质中的一个或多个串联的扩增子的位置。

32、另一方面，本发明提供了多种寡核苷酸探针，其包含第一寡核苷酸探针、第二寡核苷酸探针和第三寡核苷酸探针，其中：

33、i)第一寡核苷酸探针包含反应性化学部分；

34、ii)第二寡核苷酸探针包含条形码序列和与感兴趣的核酸互补的部分；和

35、iii)第三寡核苷酸探针包含与感兴趣的核酸互补的部分、第一条形码序列、与第一寡核苷酸探针互补的部分、以及第二条形码序列，

36、其中第三寡核苷酸探针的第一条形码序列与第二寡核苷酸探针的条形码序列互补。

37、在一些实施方案中，本公开提供了包含结构5'-[反应性化学部分]-[聚a接头序列]-[与第三寡核苷酸探针互补的部分]-[聚合阻断剂]-3'的寡核苷酸探针，其中]-[包含任选的核苷酸接头。在一些实施方案中，本公开提供了包含结构5'-[与感兴趣的核酸互补的部分]-[条形码序列]-3'的寡核苷酸探针，其中]-[包含任选的核苷酸接头。在一些实施方案中，本公开提供了寡核苷酸探针，其包含结构5'-[与第一寡核苷酸探针互补的第一部分]-[第一条形码序列]-[与感兴趣的核酸互补的部分]-[第二条形码序列]-[与第一寡核苷酸探针互补的第二部分]-3'，其中]-[包含任选的核苷酸接头。

38、另一方面，本公开提供了包含本文所述的一种或多种寡核苷酸探针的试剂盒。

39、另一方面，本公开提供了用于分析细胞中时空基因表达的系统。在一些实施方案中，该系统包括a)细胞；b)核苷类似物库，其中核苷类似物库中的每个核苷类似物包含反应性化学部分(例如，生物正交官能团，如点击化学柄)；c)第一寡核苷酸探针，其中第一寡核苷酸探针包含与核苷类似物的反应性化学部分反应的化学部分；和d)一个或多个包含第二寡核苷酸探针和第三寡核苷酸探针的寡核苷酸探针对，其中：

40、i)第二寡核苷酸探针包含条形码序列和与感兴趣的核酸互补的部分；和

41、ii)第三寡核苷酸探针包含与感兴趣的核酸互补的部分、第一条形码序列、与第一寡核苷酸探针互补的部分、以及第二条形码序列，

42、其中第三寡核苷酸探针的第一条形码序列与第二寡核苷酸探针的条形码序列互补。

43、应当理解，前述概念和以下讨论的附加概念可以以任何合适的组合排列，因为本公开在这方面不受限制。此外，当结合附图考虑时，从以下对各种非限制性实施方案的详细描述中，本公开的其他优点和新颖特征将变得显而易见。