与CD38和PD-L1结合的分子的制作方法

背景技术：

1、多发性骨髓瘤(mm)是第三常见的血液系统恶性肿瘤，每年全球有114,000例患者。尽管取得了治疗进展，但是mm仍是为数不多的具有未满足的医疗需求的血液系统恶性肿瘤之一。一旦患者在经过一线治疗后出现疾病进展，且患有复发性或难治性(r/r)疾病，治疗选择是非常有限的。然而，近年来已开发出抗-mm肿瘤靶抗原(taa)抗体。一种抗-cd38抗体达雷木单抗(daratumumab)已被批准用于治疗患有复发性mm的患者，其他抗-cd38抗体目前正在开发中(isatuximab和mor-202，在美国专利us 8,263,746中对其进行了描述)。然而，需要改善目前在30-35％范围内的应答。已证实可以通过免疫调节疗法(例如，来那度胺)增强抗-cd38抗体的活性，免疫调节疗法刺激患者的免疫系统。而且，已证实mm肿瘤细胞对抗体疗法耐受的机制之一与检验点抑制剂通路(例如，pd-1/pd-l1)信号增强有关。因此，有机会增强抗-cd38抗体对mm肿瘤细胞的细胞毒性，同时通过抑制检验点抑制剂通路(例如，pd-1/pd-l1)激活免疫系统。

2、在生理条件下，pd-l1通过下调免疫系统起到防止自身免疫的重要作用。其在“apc样”免疫细胞(t细胞、nk细胞、巨噬细胞、髓样dc、b细胞、上皮细胞、血管内皮细胞)和肿瘤细胞上表达。pd-l1与其同源受体pd-1和b7-结合，并且通过抑制其增殖和活化负向调控免疫细胞(t细胞、nk细胞等)。

3、在病理条件下，pd-l1由肿瘤细胞高表达(>90％ mm患者)并且与预后不良相关。已证实靶向免疫检验点通路的阻断抗体(抗-pd-1、抗-ctla-4、抗-pd-l1等)在多种不同类型的癌症中(肺癌、黑色素瘤等)显示出显著的活性。已在mm中观察到了有效性的迹象，但是这类有希望治疗剂的活性在mm中仍是欠佳的。其中的一个原因可能是具有有益活性/副作用性质的分子(例如，抗-pd-l1)需要接近化学计量的阻断/饱和其靶点以便对t细胞激发最大的免疫刺激作用。

4、因此，将抗-pd-l1抗体特异性靶向肿瘤部位(例如，靶向cd38+癌细胞)可能有助于将抗-pd-l1治疗剂递送至需要免疫刺激的部位，并且可以产生使得肿瘤和微环境细胞中的pd-l1完全阻断的最大免疫细胞刺激。在肿瘤部位的这种靶向免疫细胞活化还可以降低免疫细胞的系统活化、防止不良副作用以及允许更高剂量的治疗性抗体。

技术实现思路

1、为了利用t细胞、bk细胞和其他免疫细胞的细胞毒性能力治疗多发性骨髓瘤(mm)和其他癌症(优选cd38+癌症)，设计了具有两个结合位点(分别特异性针对cd38和pd-l1)的双特异性分子。本发明的双特异性分子消除了与t细胞和nk细胞上的pd-1与在肿瘤和肿瘤微环境细胞上表达的pd-l1的相互作用相关的免疫系统抑制。这种分子在治疗癌症中是有用的，特别是多发性骨髓瘤或者任意cd38+癌症，其过表达pd-l1并且在表达pd-l1的免疫细胞(浆细胞样树突状细胞，髓细胞来源的抑制细胞)微环境中生长，在这种微环境中进一步抑制t细胞和nk细胞。本发明的分子促进cd38+/pd-l1+肿瘤细胞以及肿瘤微环境细胞中的pd-l1+细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、吞噬作用以及补体依赖性细胞毒性(cdc)。

2、在本发明的一个实施方式中，工程化改造了若干包含抗-cd38和抗-pd-l1结构域的双特异性cd38/pd-l1分子。这些双特异性cd38/pd-l1分子能够同时与这两个抗原结合。

3、更具体地，工程化改造了包含抗-cd38和抗-pd-l1结构域的双特异性cd38/pd-l1抗体。这些双特异性cd38/pd-l1抗体能够同时与这两个抗原结合。

4、在一个优选的实施方式中，在cho细胞中表达双特异性cd38/pd-l1抗体，并通过使用蛋白a树脂的亲和层析对其进行纯化。在体外测定中表征抗体结合性质。其在elisa测定中同时结合cd38和pd-l1。

5、将具有图1a或1b结构的双特异性四价四fab抗体称为其为biomunextherapeutics公司的商标。

6、本发明的抗体是针对cd38和pd-l1双特异性的和二价的。本发明的抗原结合双特异性抗体是由连续的“复合重链”(由mab igg的天然重链，随后为接头以及mab2的fab重链构成)组成的全长双特异性抗体，所述“复合重链”由fc(铰链-ch2-ch3)，然后是抗体1的fab重链(ch1-vh)和抗体2连续的fab重链(ch1-vh)构成，后者通过铰链来源的多肽接头序列连接在一起，在蛋白表达过程中产生的复合重链与相同的另一条复合重链结合，同时共表达的抗体2和抗体1的fab轻链(lc)与其同源重链结构域结合以形成最终的串联f(ab')2-fc分子；抗体1(ab1)和抗体2(ab2)是不同的并且选自由抗-cd38抗体(达雷木单抗、isatuximab、mor-202或任意其他抗-cd38抗体)或其突变衍生物和抗-pd-l1抗体(阿特珠单抗、durvalumab、avelumab、mdx-1105或任意其他抗-pd-l1抗体)或其突变衍生物组成的组。

7、抗体能够与cd38和pd-l1双价结合。

8、进一步描述了由如上文所述的双特异性抗体的重链构成的多肽，以及包含编码所述多肽的序列的多核苷酸。

9、还描述了使用包含所述多肽核苷酸的表达载体转染的宿主细胞。

10、本发明的又一个目的是提供一种用于制备本发明的双特异性抗体的方法。

11、因此，提供了一种用于生产本发明的双特异性抗体的方法，所述方法包括下述步骤：a)在适宜培养基中和培养条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞表达如上文所定义的抗体重链以及如上文所定义的抗体轻链，以及b)从所述培养基中或从所述所培养的细胞中回收所述所生产的抗体。

12、本发明利用重组载体，特别是表达载体，所述表达载体包含编码本申请所定义的重链和轻链的多核苷酸以及在所选择的宿主细胞中具有活性的转录和翻译控制元件。能够用于构建根据本发明的表达载体的载体本身是已知的，并且将根据意欲使用的宿主细胞的功能特别地对其进行选择。优选地，使用编码重链的多核苷酸以及编码两条不同轻链的两个多核苷酸转化所述宿主细胞。可以将所述多核苷酸插入相同的表达载体中或者单独的表达载体中。用于生产本发明抗体的方法包括培养此类宿主细胞以及从所述培养物中回收所述抗原结合片段或抗体。

1.一种双特异性分子，所述双特异性分子包含至少一个抗-cd38结构域和至少一个抗-pd-l1结构域，其能够同时分别结合至cd38和pd-l1抗原，所述双特异性分子是全长抗体，所述抗体包含两条重链和四条轻链，

2.根据权利要求1所述的双特异性分子，其中ab1是所述抗-cd38抗体和ab2是所述抗-pd-l1抗体。

3.根据权利要求1所述的双特异性分子，其中ab1是所述抗-pd-l1抗体和ab2是所述抗-cd38抗体。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的双特异性分子，其中所述ab1的ch1和cl结构域具有与ab2的所述ch1和cl结构域不同的序列。

5.根据权利要求1至3中任意一项所述的双特异性分子，其中ab1或ab2之一的所述fabch1结构域是突变结构域，其来自于所述ch1结构域192位的苏氨酸残基被天冬氨酸残基取代的免疫球蛋白的ch1结构域，以及所述同源cl结构域是突变结构域，其来自于所述cl结构域137位的天冬酰胺残基被赖氨酸残基取代和所述cl结构域114位的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代的免疫球蛋白的cl结构域，和/或其中所述ab1或ab2的一个或另一个的fab ch1结构域是突变结构域，其来自于所述ch1结构域124位的亮氨酸残基被谷氨酰胺残基取代和所述ch1结构域188位的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代的免疫球蛋白的ch1结构域，以及所述同源cl结构域是突变结构域，其来自于所述cl结构域133位的缬氨酸残基被苏氨酸残基取代和所述cl结构域176位的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代的免疫球蛋白的cl结构域，其中氨基酸是根据kabat来编号的。

6.根据权利要求1至5中任意一项所述的双特异性分子，所述双特异性分子包含a)两条重链和b)四条轻链，每条所述重链包含seq id no:10，以及两条所述轻链包含seq id no:11和另外两条所述轻链包含seq idno:12。

7.一种多肽，所述多肽包含权利要求1至6中任意一项所定义的双特异性分子的重链。

8.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求7所述的多肽的序列。

9.一种转染了表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含权利要求8所述的多核苷酸。

10.一种用于生产权利要求1至6中任意一项所述的双特异性分子的方法，所述方法包括下述步骤：

11.权利要求1至6中任意一项所述的双特异性分子，其用作药物。

12.权利要求1至6中任意一项所述的双特异性分子，其用于治疗多发性骨髓瘤。