猪链球菌保护性抗原ESPss的基因序列、表达方法及其应用

本发明涉及猪链球菌保护性抗原espss的基因序列、表达方法及其应用，属于动物免疫。

背景技术：

1、猪链球菌是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，作为一种条件致病菌，广泛存在于猪的呼吸道、消化道和生殖道中，健康猪也100％带菌。猪链球菌在自然界中分布广泛，血清型种类繁多，不仅猪、马、牛、羊及家禽都可以成为其感染宿主，还可以导致人的感染，是一种重要的人畜共患病。在早期感染病原时，病猪会出现发热、精神萎靡等症状。主要的临床症状表现为淋巴结局部化脓性病症和败血症。

2、猪链球菌病的诊断依据通常通过对临床症状的辨别和对病理部位进行剖检观察，以此进行初步诊断。如需确诊则需要通过一系列的实验室方法，实验室主要流行的检测方法有三大类：病原分离培养及生化鉴定、血清学鉴定、分子水平鉴定。利用高倍显微镜进行检测，链球菌为革兰氏阳性菌在革兰氏染色镜检呈现紫色，形状为圆球形或椭圆形，呈短链状排列或成串排列。目前根据荚膜多糖的不同，将猪链球菌分为35个血清型(1/2,1～34型)，但仍有相当数量的猪链球菌菌株无法定型，其中猪链球菌2型、7型及9型是常见致病的血清型，猪链球菌2型是临床上分离的最多的血清型，毒力最强。

3、猪链球菌病的治疗目前主要依赖于抗生素，但是长期使用抗生素会导致菌株产生耐药性，因此应对猪链球菌应该采取更加科学的方法，因此疫苗成为了预防猪链球菌病最科学的方法。目前可用于防治猪链球菌的疫苗包括活菌苗、灭活疫苗和基因工程疫苗。

4、随着生物技术的不断发展，基因工程疫苗的开发越来越受到重视，猪链球菌基因工程苗亚单位疫苗重要的一步是保护性抗原的筛选。刘丽娜通过对中国和荷兰的4株猪链球菌的基因比对分析，发现rfea基因相似性为100％，推测该基因非常保守。通过原核表达后的蛋白免疫小鼠后，用2型强毒株oszyh33攻击，结果表明rfea免疫组的小鼠存活率为90％，明显高于对照组，说明该蛋白具有较好的免疫原性。位于细胞表面的hp0245，经过原核表达后，免疫原性分析后发现，在高剂量的ss2攻毒时能提供80％的保护力，同源的hp0245基因与编码胞外肽段的高度保守序列存在于大部分ss标准菌株中，因此hp0245能够成为研制亚单位疫苗的候选蛋白。enolase被证实在所有血清型的猪链球菌中都有表达，是一段高度保守的序列。有研究证实在小鼠模型上，用特殊佐剂乳化的enolase，可诱导显著的体液免疫应答，并可以为致死剂量的ss2和ss7的感染提供有效保护。

技术实现思路

1、现有研究的保护性抗原目前仅对2型强毒株具有一定的保护效果，而对其他类型的猪链球菌的保护效果不佳，为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种猪链球菌广谱保护性抗原espss(extracellular solute-binding protein of s.suis)及其基因序列，并公开其制备方法及具体应用。

2、本发明上述技术效果通过下述技术方案实现：

3、一种猪链球菌保护性抗原espss的基因序列，其核苷酸编码序列如seq.no:1所示。上述核苷酸编码序列由上海派森诺生物限公司完成合成得到。

4、本发明还提供一种上述所述的猪链球菌保护性抗原espss的制备方法，其包括如下步骤：

5、1)人工合成seq.no:1所示的核苷酸序列；使用带有ecorⅰ和xhoⅰ酶切位点的引物对对核苷酸序列进行扩增，其中正向引物如seq.no:2所示，反向引物如seq.no:3所示；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后使用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收纯化，得到目的基因pcr产物；

6、2)构建重组质粒pet28a-espss：使用ecorⅰ和hindiii酶对目的基因pcr产物和pet-28a阳性质粒分别进行双酶切处理；回收经过双酶切处理过的espss基因和pet-28a阳性质粒在16℃金属浴条件下过夜进行连接反应；

7、3)连接产物测序鉴定后转化到大肠杆菌bl21(de3)中，将转化后的感受态细胞转接于具有kan抗性的lb液体培养基中逐级培养，培养温度为37℃；

8、4)控制培养温度、培养时间和iptg的浓度诱导重组espss蛋白的表达，上清液收集后经镍柱纯化和富集除盐，得到重组蛋白的大小为50kda的espss抗原，利用western blot验证其抗原性。

9、如上所述的猪链球菌保护性抗原espss的制备方法，其中步骤1)中扩增体系的组成如下：lataq酶25μl，正向引物1μl，反向引物1μl；模板2μl，ddh2o 21μl，pcr扩增条件为：95℃预变性2min；95℃30s，55℃30s，72℃1min 30s，35个循环，72℃延伸10min。

10、如上所述的猪链球菌保护性抗原espss的制备方法，所述步骤2)中目的基因pcr产物的酶切体系的组成为：10×buffer 2μl，espss基因9μl，ecorⅰ酶0.5μl，xhoⅰ酶0.5μl，ddh2o 8μl；pet-28a质粒的酶切体系的组成为10×buffer 2μl，pet-28a质粒9μl，ecorⅰ酶0.5μl，xhoⅰ酶0.5μl，ddh2o 8μl。

11、如上所述的猪链球菌保护性抗原espss的制备方法，所述步骤2)中连接反应体系的组成为：10×buffer 1μl，espss基因7μl，pet-28a质粒1.5μl，t4 dna连接酶0.5μl。

12、如上所述的猪链球菌保护性抗原espss的制备方法，所述步骤3)中测序鉴定步骤具体包括：连接反应产物转化到感受态细胞dh5α,转化后菌液涂在卡那霉素的lb琼脂平板上培养，挑取单菌落转接到lb液体培养基，收集菌液并提取质粒进行测序，并与目的片段进行比对分析。

13、本发明步骤1)中在引物序列中引入酶切位点ecorⅰ和xhoⅰ酶切位点，主要是便于后续与原核表达载体的重组反应。

14、如上所述的猪链球菌保护性抗原espss的制备方法中，所述的连接产物转化鉴定具体包括下述步骤：

15、将连接产物加入到解冻完成的感受态细胞中，42℃水浴热激90s，立即置于冰上2min；室温条件下加入lb培养基，200rpm，37℃下振荡培养1h；将培养完成的感受态细胞培养液8000rpm离心2min后弃去上清，使用培养基重悬菌体，取50μl菌液均匀地涂在卡那霉素的lb琼脂平板上，37℃下倒置过夜培养；挑取平板上单菌落转接至带有卡那霉素抗性的lb液体培养基37℃振荡过夜培养；收集菌液，菌液pcr后使用试剂盒提取质粒，测序，获取的序列利用snapgene软件与目的片段进行比对分析。

16、本发明还请求保护猪链球菌保护性抗原espss基因序列表达的espss蛋白。本发明所述的espss蛋白在预防2型、7型、9型血清型猪链球菌感染中的应用。本发明实施例2表明所述的espss蛋白能够显著提升宿主动物的抗体ig g的表达水平。实验结果显示，首次免疫时使用保护性抗原免疫和未使用保护性抗原免疫的小鼠抗体igg水平相当，无显著性差异。首次免疫的第13天和二次免疫后第9天后，使用保护性抗原免疫的igg水平显著高于未使用保护性抗原免疫的小鼠，且二次免疫后第9天小鼠的igg水平高于首次免疫的第13天，这表明本发明所述的保护性抗原的能够显著提升小鼠的抗体表达水平。

17、本发明实施例2显示，所述的espss蛋白能够显著提升宿主动物血清及脏器细胞因子il-4和ifn-γ的表达水平。实验结果显示，不论是在血清中还是在肺脏和脾脏中，使用保护性抗原免疫的小鼠的il-4和ifn-γ的表达水平均明显高于对照组。这表明，所述的保护性抗原具有显著提升il-4和ifn-γ的表达水平的作用。

18、本发明与现有技术中的保护性抗原相比，对猪链球菌不同血清型的保护作用更为广谱，具有显著的调节细胞因子和免疫增强效果，具有如下技术优势：

19、1)本发明espss蛋白不仅对于2型血清型猪链球菌感染具有很好的保护作用，而且对于7型、9型猪链球菌感染均具有很好的免疫保护作用。本发明实施例2表明，本发明实施例2表明所述的espss蛋白能够显著提升宿主动物的抗体ig g的表达水平。

20、2)本发明所述的espss蛋白能够调节血清及脏器细胞因子的效果，本发明实施例2

21、表明，所述的espss蛋白能够显著提升宿主动物血清及脏器细胞因子il-4和ifn-γ的表达水平。