利用CUT&Tag技术进行海洋无脊椎动物蛋白质与基因组DNA互作研究的实验方法

本发明涉及海洋无脊椎动物表观遗传学，尤其涉及利用cut&tag技术进行海洋无脊椎动物蛋白质与基因组dna互作研究的实验方法。

背景技术：

1、动物从单细胞受精卵发育成具有不同细胞组成和生理功能的组织和器官的过程受到多个层面的基因表达调控。细胞特异性存在/表达的转录因子通过结合到靶基因的启动子或者增强子等基因表达调控元件上，调控目的基因的表达进而实现特定细胞发育路径的调控。表观遗传调控则在不改变dna序列的前提下，通过dna甲基化、组蛋白修饰、非编码rna等影响dna的可及性或rna的稳定性，从而调控相关基因的表达与否或水平高低。组蛋白修饰是表观遗传调控的重要方式。组蛋白上不同氨基酸位点的甲基化、乙酰化或磷酸化修饰，会影响染色质的结构和紧密度，从而影响dna序列的可及性和转录因子与dna的结合能力，进而调节基因的表达。

2、chip-seq技术是传统的研究转录因子或组蛋白与dna相互作用的研究手段，其原理是利用甲醛使dna和蛋白质交联，再用酶解法或者超声法进行染色质的片段化，用目标蛋白的抗体富集蛋白质dna复合物后利用高通量测序技术获取目的蛋白所结合dna区域的序列信息。在2019年，蛋白质-dna互作研究新技术cut&tag(cleavage under targets andtagmentation)由henikoff团队开发出来，其原理如下：由cona包被的磁珠活化后固定活细胞或细胞核，使用digitonin进行细胞膜的通透性改变，使一抗得以进入细胞与目标蛋白结合，利用二抗与一抗结合放大信号后，预装接头的蛋白a/g(pa/g)融合tn5转座酶进入细胞核与二抗结合，tn5转座酶在加入mg2+后被激活，将目标蛋白所结合的dna片段剪切下来的同时加上测序文库接头，pcr扩增后进行高通量测序从而得到目标蛋白在基因组中所结合的dna位点信息。与chip-seq技术相比，cut&tag技术所需细胞数量少，操作时间短，并且信噪比高，数据重复性好，具有明显优势。目前cut&tag技术主要应用于哺乳动物、酿酒酵母、果蝇、拟南芥、小鼠胚胎、斑马鱼等物种，在海洋生物的应用仅见于大黄鱼，尚未见有关cut&tag技术在海洋无脊椎动物中应用的报道。

3、以对虾和贝类为代表的海洋无脊椎动物不仅在动物分类进化上具有重要的研究价值，同时也是世界水产养殖的重要物种。无脊椎动物中的节肢动物门和软体动物门分属动物界第一和第二大门类。隶属于节肢动物门的凡纳滨对虾是我国主要养殖虾类品种。据不完全统计，凡纳滨对虾占所有海水养殖虾类产量的65％，加上淡水养殖部分，其产量占中国所有养殖虾类总产量的80％。双壳贝类是软体动物门各纲中种类较多和经济价值最大的一个纲，包括扇贝、贻贝、牡蛎和蛤蜊等多种重要水产养殖物种，具有极高的研究价值。侏儒蛤是进行双壳贝类生物学研究的良好模式物种，其具有典型的双壳贝类发育模式和一般特性，并且具有软体动物古老核型和基因库代表性。此外，侏儒蛤还具有易于实验室人工养殖和繁育、个体小、繁殖率高、世代周期短、幼虫和幼贝发育过程形态透明等诸多研究优势。对侏儒蛤和凡纳滨对虾胚胎发育分子调控机制的研究，可以为贝类和虾类的高效生产提供理论依据。

4、利用cut&tag技术对侏儒蛤和凡纳滨对虾胚胎发育过程的组蛋白修饰状态变化进行研究，可以帮助了解基因及增强子等顺式调控元件所在染色质区域的开放状态随着发育进程的变化，进而了解胚胎发育相关关键基因表达调控的规律和分子机制。然而，由于海洋无脊椎动物细胞渗透压的差异，目前已有的cut&tag技术方案无法很好的应用于侏儒蛤和凡纳滨对虾蛋白质-dna互作研究。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，以侏儒蛤和凡纳滨对虾为例提出的利用cut&tag技术进行海洋无脊椎动物蛋白质与基因组dna互作研究的实验方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、利用cut&tag技术进行海洋无脊椎动物蛋白质与基因组dna互作研究的实验方法，包括以下步骤：

4、s1、催产；

5、s2、受精和培养受精卵；

6、s3、配制试剂；

7、s4、解离单细胞或提取细胞核；

8、s5、细胞或细胞核计数；

9、s6、处理cona beads；

10、s7、细胞(细胞核)和cona beads孵育；

11、s8、一抗孵育；

12、s9、二抗孵育；

13、s10、高活性pa/g-tn5转座酶孵育；

14、s11、片段化；

15、s12、dna提取；

16、s13、测序文库的扩增；

17、s14、扩增产物纯化；

18、s15、测序。

19、进一步的技术方案，在s1中，侏儒蛤提前阴干2h，随后26℃纯净海水刺激催产，凡纳滨对虾在孵化池自然催产。

20、进一步的技术方案，在s2中，侏儒蛤受精时精子适量，受精后筛绢过滤精子，受精卵置于24℃恒温培养箱中培养，凡纳滨对虾受精后置于孵化池培养。

21、进一步的技术方案，在s3中，根据侏儒蛤与凡纳滨对虾胚胎渗透压，若后续解离单细胞进行试验，需配制试剂：0.25％胰蛋白酶溶液、binding buffer、wash buffer、dig-wash buffer、antibody buffer、dig-300 buffer、tagmentation buffer、te buffer。若后续提取细胞核进行试验，需配制试剂：ne1 buffer、binding buffer、wash buffer、dig-wash buffer、antibody buffer、dig-300 buffer、tagmentation buffer、te buffer。

22、进一步的技术方案，在s4中，待侏儒蛤胚胎发育到所需时期时，0.25％胰蛋白酶，室温消化10min，移液枪吹打2-3min直到完全解离，wash buffer洗涤2-3次。待凡纳滨对虾胚胎发育到所需时期时，wash buffer冲洗胚胎2-3次，去除海水，加入冰冷ne1缓冲液，置于冰上用手术剪剪碎胚胎，移液枪吹打直至完全解离，冰上静置8min使细胞充分裂解，washbuffer洗涤2-3次。

23、进一步的技术方案，在s5中，细胞或细胞核过40μm细胞筛，台盼蓝染色观察细胞活性及细胞和细胞核计数。

24、进一步的技术方案，在s6中，binding buffer重悬活化cona beads。

25、进一步的技术方案，在s7中，wash buffer重悬细胞或细胞核，加入活化conabeads，室温旋转孵育10min。

26、进一步的技术方案，在s8中，用预冷的加入一抗的antibody buffer重悬细胞或细胞核，轻轻涡旋混匀，室温旋转孵育2h或置于摇床4℃过夜孵育。

27、进一步的技术方案，在s9中，用加入二抗的dig-wash buffer重悬细胞或细胞核，室温旋转孵育1h，dig-wash buffer洗涤细胞或细胞核3-4次。

28、进一步的技术方案，在s10中，加入高活性pa/g-tn5转座酶的dig-300 buffer重悬细胞或细胞核，室温旋转孵育1h，dig-300buffer洗涤2-3次。

29、进一步的技术方案，在s11中，加入tagmentation buffer重悬细胞或细胞核，37℃孵育1h。在室温条件下，加入10μl 0.5m edta，3μl 10％ sds和2.5μl 20mg/ml proteinasek，终止片段化反应。

30、进一步的技术方案，在s12中，50℃孵育1h，tris饱和酚和氯仿提取dna，100％乙醇沉淀dna，te buffer溶解dna沉淀。

31、进一步的技术方案，在s13中，所述pcr的反应体系包括：dna模板，ddh2o、tabbuffer、预装接头p5及p7端引物、tae buffer，反应程序根据细胞或细胞核数量而定，pcr产物用琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。

32、进一步的技术方案，在s14中，使用dna clean beads及乙醇纯化pcr产物，ddh2o洗脱，pcr纯化后产物用琼脂糖凝胶电泳及qubit进行质量检测，确认无误后产物保存于-20℃。

33、进一步的技术方案，在s15中，使用nova-pe150测1g raw data/文库数据量。

34、本发明的有益效果为：

35、1、本发明中，针对渗透压特殊的海洋无脊椎动物，通过调整实验过程试剂溶液为合适的适宜渗透压，成功实现了cut&tag技术在海洋无脊椎动物(如侏儒蛤)上的应用突破。

36、2、本发明中，针对难以解离为单细胞的组织(如凡纳滨对虾早期胚胎)采用提取细胞核方法，成功实现了cut&tag技术在难以解离为单细胞的海洋无脊椎动物组织的应用突破。

37、3、本发明的试验方法克服了现有cut&tag技术在海洋贝类和对虾中应用的缺陷和不足，解离单细胞进行试验调整了实验渗透压，提细胞核进行实验解决某些物种组织无法成功解离单细胞的问题，使cut&tag技术可应用于海洋无脊椎动物侏儒蛤和凡纳滨对虾，而且促进海洋无脊椎动物表观遗传学领域的发展，并为贝类和虾类的高效生产提供理论依据。