一种提高大豆分枝和种子数量的方法

本发明属于作物育种和基因工程，尤其涉及一种提高大豆分枝和种子数量的方法。

背景技术：

1、目前，随着转基因技术的不断开放，转基因产品带来的产量和品质上的优势显而易见，能够大大提高人们日益增长的物质需求。市面上常见的转基因作物有转基因大豆、转基因玉米、转基因番茄和转基因棉花等，这些都是通过安全验证的转基因农产品。中国作为农业生产大国，自2008年国家批准设立了转基因重大专项以来，我国科研人员克隆了100多个重要基因，获得1000多项专利，专利总数仅次于美国，居世界第二位。我国转基因农作物采用“非食用-间接食用-食用”的发展路径，首先发展非食用的经济作物，其次是饲料作物、加工原料作物，再次是一般食用作物，最后是口粮作物。当前，我国获批商业化种植的转基因作物仅有抗虫棉和抗病番木瓜，根据农业农村部数据显示，2019年，我国转基因棉花和番木瓜种植面积达320万公顷，其中棉花占比约为99％，番木瓜占比较低。另外，我国还批准了转基因大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜等5种国外研发的转基因农产品作为加工原料进入国内市场。但是我国的食用的转基因作物还并未获许进行商业化种植。然而在2022年6月8日农业部发布《国家转基因大豆玉米品种审定标准》，标志着我国生物育种产业化应用又迈出重要一步。根据《农业转基因生物安全管理条例》及相应配套制度，我国转基因种子审批需经历转基因作物安全评价(中间试验+环境释放+生产性试验+取得安全证书)以及品种审定。而基因编辑技术虽然也是一种基因工程技术，但是不会引入外源基因片段或者大片段序列，相对来说安全风险极低。

2、转基因材料的获取实际上是通过基因工程，将生物体内控制特定性状的基因作为外源基因，按照人们的意愿在体外进行改造加工后，再引入受体植物，使其在生物体内稳定存在并表达。转基因产品优势，可以解决粮食短缺问题，减少农药的施用，节省生产陈本，增加食物营养，增加食物种类和促进了生产效率。然而转基因产品也存在一些未知的弊端，转基因违反自然规律有很多不确定因素，植物中导入杀虫、抗除草剂基因可能存在潜在危险，对农业生态环境的影响，转基因技术有可能会造成生物污染等。

3、基因编辑植物是否是转基因植物，这是基因编辑作物是否能顺利进入田间种植的关键所在。美国农业部已经确定了基因编辑的作物免于转基因作物的监管，但是欧盟最高法院最终规定基因编辑的作物应遵守与传统转基因生物相同的严格法规，这一决定对包括科学家在内的基因编辑作物的支持者来说是一个重大挫折。相关的植物科学家指出随着基因编辑工具的出现，需要重新考虑转基因生物的当前定义和相应的调控框架，因为通过基因编辑方法实现的基因组修饰与转基因技术的基因组修饰非常不同。并且大多数crispr诱导的基因突变是小插入缺失而不是大片段插入或重排。而这种小的插入缺失变异通常也存在自然条件下生长的植物中，或使用辐射或化学诱变剂大规模诱导的植物中。其次，传统转基因植物中转基因是稳定遗传，而使用crispr和其他基因编辑工具构建的性状改良植物可以是无转基因的。因此，有科学家认为无转基因编辑的植物应该采用与传统化学或辐射诱变培育的植物相同的方式进行处理，不应受到特殊的管理政策的约束。基因编辑植物或许是我国转基因农作物获得商业化种植的突破口。

4、为规范农业用基因编辑植物安全评价工作，根据《农业转基因生物安全管理条例》和《农业转基因生物安全评价管理办法》，2022年1月24日，农业农村部制定公布了《农业用基因编辑植物安全评价指南(试行)》，主要针对没有引入外源基因的基因编辑植物，依据可能产生的风险申请安全评价。进一步规范农业基因编辑植物的安全评价管理，对于我国生物育种技术研发与产业推动具有里程碑意义。本次指南的发布，将基因编辑这项革命性的技术纳入有效管理，为基因编辑产业化的应用指明方向，对于打好种业翻身仗，保障国家粮食安全具有重要意义，对解决日益增长的世界人口粮食危机具有重大价值。

5、在此前的研究中，分枝是大豆株型的重要影响因素之一，良好的株型有助于提高大豆产量，而分枝的变多可进一步增加节间数量，进而增加种子的数量。

6、大豆富含丰富的蛋白质和油脂，目前我国需要的大豆对外依存度高达八成之多，国内大豆的问题是产业供给不足。基因gmsbasn1影响一氧化氮信号，来调控表型，其对大豆主要作用在提高大豆分枝数和种子数量。

7、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：传统的转基因技术由于引入外源片段导入基因组对整个基因的改造，且该转基因是稳定遗传的，而使用crispr和其他基因编辑工具构建的性状改良植物可以是无转基因的，故安全风险较高。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高大豆分枝和种子数量的方法。

2、本发明是这样实现的，通过crispr-cas9的转基因编辑技术，构建了具有三突变体的gmsbasn1材料观察发现是能够提高大豆分枝和种子数量。主要方法包括：获取在大豆种子和豆荚中高表达的基因gmsbasn1；在大豆gmsbasn1基因的起始密码子后选取位点进行移码突变基因编辑，使得gmsbasn1基因不表达，从而提高大豆分枝进而实现大豆分枝数的提高。

3、进一步，大豆gmsbasn1基因包括gmsbasn1a、gmsbasn1b和gmsbasn1c，gmsbasn1a的核苷酸序列为sbasn-seq-no.1，gmsbasn1b的核苷酸序列为sbasn-seq-no.2，gmsbasn1c的核苷酸序列为sbasn-seq-no.3。

4、进一步，移码突变包括插入或缺失，靶位点pam序列为seq id no.4。

5、进一步，靶位点的基因编辑采用crispr/cas9基因编辑技术进行实现。

6、进一步，crispr/cas9基因编辑技术包括：

7、(1)人工合成大豆gmsbasn1的靶位点基因片段，将靶位点基因片段连接至载体cas9mdc123上，构建包含靶位点基因片段的重组载体；转化农杆菌，获得含重组载体的农杆菌；

8、(2)用步骤(1)含重组载体的农杆菌菌液侵染大豆外植体，经过连续繁种，筛选不含cas9蛋白且gmsbasn1基因已经成功被编辑且纯合的株系，获得大豆分枝和种子数量提高的株系。

9、进一步，步骤(1)中构建的包含靶位点基因片段的重组载体为cas9mdc123-靶位点基因片段。

10、进一步，步骤(2)中的gmsbasn1基因已经成功被编辑且纯合为：gmsbasn1基因中的gmsbasn1a、gmsbasn1b和gmsbasn1c均被有效编辑。

11、进一步，gmsbasn1基因均被有效编辑是指gmsbasn1基因的靶位点处出现碱基缺失或插入的情况，从而发生移码，使蛋白表达提前终止。

12、进一步，提高大豆分枝和种子数量的方法包括以下步骤：

13、步骤一，构建cas9mdc123-gmsbasn1表达载体；

14、步骤二，cas9mdc123-pam转化农杆菌；

15、步骤三，农杆菌介导cas9mdc123-pam转化大豆子叶节；

16、步骤四，筛选阳性苗并进行性状分离获取不含cas9蛋白的突变株系gmsbasn1a/b/c；

17、步骤五，对基因编辑大豆纯合三突变株系gmsbasn1a/b/c进行表型分析。

18、进一步，提高大豆分枝和种子数量的方法还包括：

19、利用辐射和/或化学诱变的方式阻止gmsbasn1基因的表达，获得gmsbasn1的突变体进而提高大豆分枝数量；同时，在大豆遗传资源中筛选gmsbasn1基因不表达或低表达的单倍型，实现大豆分枝数的提高。

20、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

21、第一，针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：

22、本发明提供了一种通过对大豆亚硝基谷胱甘肽还原酶基因gmsbasn1(shootbranching and seednumber 1)的基因编辑使其不表达，进而提高大豆分枝数和种子数量的方法。本发明选取了一个在大豆种子和豆荚中高表达的基因gmsbasn1进行基因编辑，通过影响no的信号通路来增加大豆分枝数和种子数量，从而获得多分枝，单株种子数量增多的材料。

23、本发明通过crispr/cas9基因编辑技术对大豆gmsbasn1基因进行基因编辑使其不表达，通过提高大豆的分枝来进一步增加种子数量的方法。本发明通过对收货后种子表型进行比较发现，gmsbasn1进行基因编辑尽管使得种子大小发生改变，但未减少种子数量。此外，本发明基因编辑虽本质上仍是一种转基因技术，但是又不同于传统的转基因技术，本发明在t0代苗引入的cas9蛋白以及表达载体上的其他外源片段均可以在后代通过性状分离的方式进行筛选，选取不存在任何外源片段插入仅在gmsbasn1的靶位点发生突变的株系。本发明获得的突变位点纯合且无外源片段插入的株系的大豆不仅增加大豆分枝，并且对大豆的种子数量提高，因其未引入外源片段，安全风险极低，为后续我国将具有优良性状的转基因大豆投入商业化种植提供了更多的可行性。

24、第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：

25、本发明实验发现，gmsbasn1主要在种子发育时期的荚和种子中高表达，在根、茎、叶等其他的组织中表达量不高，基因编辑后明显观察到分枝数量的增多，荚数量变多，收获后尽管种子变小，但数量显著增多，最终单株的总重量增加。本发明提供的提高大豆分枝和种子数量的方法可扩展到通过其他手段，如辐射、化学诱变等阻止gmsbasn1基因表达，获得gmsbasn1的突变体来提高大豆分枝数；同时，在大豆遗传资源中筛选gmsbasn1基因不表达或低表达的单倍型，也可实现大豆分枝数量的提高，也是本发明涵盖的内容。

26、第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：

27、本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：

28、目前我国转基因技术还未正式开放，大豆作为我国主要的进口作物之一，去年就超过一亿吨，本发明能够提高大豆分枝和种子数量，有效缓解我国大豆供给压力。