一种槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法及应用

本发明涉及了微生物提取，尤其涉及一种槟榔叶表微生物基因组dna提取方法及应用。

背景技术：

1、植物叶表生境广阔，可供微生物生存的总面积超过6.4×108km2，约是陆地表面积的两倍，是陆生微生物的一个巨大且极其多样化的栖息地，也是地球上最大的微生物栖息地之一。叶表面的环境是复杂而动态的，生活在叶表的微生物经常要面临水分和营养物质的不足，以及剧烈变化的强光、高温和高紫外线等的影响。尽管如此，仍有大量微生物能够适应叶表环境并生存下来，在与植物长期的互作交流过程中形成了正面、负面或共生的关系。研究发现，叶表微生物中只有少数致病，大多数都是有益的，在促进植物生长、增强植物抗病性、降解环境污染物、生物传感检测等方面发挥了重要作用。

2、传统方法研究叶表微生物主要依赖于培养技术和显微技术，不能完全反映微生物群落信息的真实情况。目前以高通量测序为代表的新一代分子生物学技术为揭示叶表微生物群落结构及功能的关系提供了强有力的工具，测序结果的准确性取决于叶表微生物基因组dna的质量，要想获得纯度高、结构完整的基因组dna，首先要收集到足够的微生物。由于各种叶片形态差异，叶片的结构和表面化学构成了一个特殊的微环境，微生物在叶片表面分布不均，且叶片最外侧蜡质层具有疏水性，微生物附着在上面被整合成生物膜，难以分离洗脱，影响后续实验，所以针对叶表微生物的收集选择适合的前处理方法至关重要。

3、槟榔(arecacatechul.)属棕榈科常绿乔木，是我国四大南药之首，也是海南省重要的热带经济作物，发展前景十分广阔。研究槟榔叶表微生物多样性对发掘热带优良微生物资源、解析棕榈科植物与微生物的互作关系有重要意义。槟榔叶片为大型羽状全裂单叶，长达1.5～2m，叶表微生物收集和基因组dna提取难度较大，制约了高通量测序技术的应用。为解决槟榔叶表微生物多样性丰富但可获取的数量少这一难题，本技术比较了不同样本量和洗脱液成分对提取槟榔叶表微生物基因组dna质量的影响，通过改良前处理方法洗脱并收集到更多的叶表微生物，提高效率，为研究槟榔叶表微生物群落结构及多样性奠定基础。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种槟榔叶表微生物基因组dna提取方法及应用，通过改良前处理方法洗脱并收集到更多的叶表微生物，提高效率，为研究槟榔叶表微生物群落结构及多样性奠定基础。

2、本发明涉及的一种槟榔叶表微生物基因组dna提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

3、槟榔叶片的采集，用灭菌剪采集树冠的叶片，戴无菌手套挑选表面干净无病虫害的小裂叶放入无菌袋，迅速冷冻于干冰中带回实验室，转移到-80℃冰箱保存；

4、洗脱液的配置，所述洗脱液包括表面活性剂和溶剂，所述表面活性剂和所述溶剂的比例为1：5000，所述溶剂为pbs缓冲液或无菌水；

5、叶表微生物的收集，在超净工作台上，用无菌剪刀将叶片剪成3cm×4cm的小块，称取叶片25g-125g，放入前处理容器中，加入洗脱液，洗脱液的容量应没过叶片，进行前处理，然后去除叶片，在无菌环境中使用真空抽滤装置将瓶内的微生物收集到0.22μm孔径滤膜上；

6、基因组dna的提取及质量检测；

7、pcr扩增检测；

8、所述前处理包括将前处理容器放入摇床中，25℃，以200r/min的速度振荡20min，洗脱叶表微生物。

9、进一步地，在叶表微生物的收集过程中，所述槟榔叶片的重量为75g。

10、进一步地，所述基因组dna的提取及质量检测包括，将滤膜置于预冷的研钵中，加入液氮进行研磨，然后按照改良ctab法对基因组dna进行提取，-20℃冰箱保存，使用超微量分光光度计对提取的dna浓度和纯度进行检测；用1％琼脂糖凝胶对提取的dna质量进行检测，电压120v，电泳时间30min。

11、进一步地，所述pcr扩增检测包括，

12、pcr反应体系：包括模板dna0.5μl，kodfxneobuffer5μl，dntp2μl，上下游引物各0.3μl，kodfxneo0.2μl，最后用双蒸水补足至10μl；

13、所述上游引物包括338f和its1f，所述下游引物包括806r和its2；

14、所述338f的序列为：5'-actcctacgggaggcagca-3'；

15、所述its1f的序列为：5'-cttggtcatttagaggaagtaa-3'；

16、所述806r的序列为：5'-ggactachvgggtwtctaat-3'；

17、所述its2的序列为：5'-gctgcgttcttcatcgatgc-3'。

18、进一步地，所述pcr扩增检测还包括，采用引物338f和806r对细菌16srdna基因的v3-v4区进行扩增，pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，25个循环；72℃延伸7min。

19、采用引物its1f和its2对真菌its1区进行扩增，pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸7min，获得pcr产物；

20、pcr产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。

21、进一步地，所述对滤膜中的基因组dna进行提取采用改良ctab法、土壤基因组dna提取试剂盒法或植物基因组dna提取试剂盒法。

22、所述改良ctab法包括：

23、s1、将滤膜置于研钵中，加入液氮充分研磨成粉末，并迅速收集到2ml离心管中，加入1ml缓冲液，涡旋混匀，冰浴10min，4℃、10000r/min离心10min，弃上清，所述缓冲液包括100mmol/ltris-hcl，20mmol/ledta，5％甘油，2％pvp，2％β-巯基乙醇，tris-hcl和edta的ph值为8.0；

24、s2、加入800μl65℃预热的ctab裂解液，混匀后在65℃保温30min，其间不断晃动，使材料与缓冲液混合充分，所述ctab裂解液包括2％ctab，1.4mol/lnacl，20mmol/ledta，100mmol/ltris-hcl，0.2％β-巯基乙醇，tris-hcl的ph值为8.0；

25、待材料冷却至室温后加入800μl的第一混合液，所述混合液中苯酚：氯仿：异戊醇的比例为25：24：1，颠倒混匀，12000r/min离心10min，获得第一上清液，将第一上清液转移至新的离心管中，加入等体积的第二混合液，所述第二混合液包括氯仿和异戊醇，所述氯仿和异戊醇的比例为24：1，颠倒混匀，12000r/min离心10min，获得第二上清液；

26、吸取500μl第二上清液至新的1.5ml离心管中，加入50μl3mol/lnaac和500μl异丙醇，颠倒混匀，室温静置15min，12000r/min离心10min，弃上清液；

27、用75％乙醇和无水乙醇各洗涤沉淀1次，12000r/min离心5min，弃上清，置阴凉通风处晾干；

28、最后，用60μl灭菌ddh2o溶解dna，加入10μlrnasea，颠倒混匀，并将其置于-20℃下保存。

29、本发明还涉及一种槟榔叶表微生物基因组dna提取方法在研究槟榔叶表微生物群落结构及多样性中的应用。

30、本发明的有益之处在于：通过超微量分光光度计测定、琼脂糖凝胶电泳、pcr扩增的验证，得出槟榔叶片样本量在75g时，以无菌水+silwetl-77作为洗脱液可以富集到足够多的叶表微生物，所提取的基因组dna浓度和纯度满足实验要求，且成本最低，为最佳前处理方法。通过改良前处理方法洗脱并收集到更多的叶表微生物，提高效率，为研究槟榔叶表微生物群落结构及多样性奠定基础。

31、为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。