一种快速提取并检测肿瘤高表达ABCB1基因mRNA的试剂盒及其检测方法

本发明涉及体外诊断领域的核酸提取技术，特别涉及一种提取并检测abcb1 mrna表达量的试剂盒。

背景技术：

1、多药耐药现象(mdr)是指肿瘤细胞对某种化疗药物产生耐药性，同时对其它结构上无关、作用机理各异的抗肿瘤药物也产生交叉耐药性。mdr最初发现于肿瘤细胞，其产生的主要原因之一是肿瘤细胞中的abcb1 mrna过表达使得细胞膜产生过量的药物外排转运载体蛋白p-糖蛋白即p-gp。

2、多药耐药基因abcb1是abc转运蛋白家族中最重要的转运蛋白成员。其编码转运蛋白和通道蛋白，起着外排泵的作用，负责维持细胞内稳态，使药物外排的速率增加，从而降低血浆和淋巴液等体液中的药物浓度。经过糖基化后，abcb1编码一种长度为1280个氨基酸的蛋白质，称为p-糖蛋白(p-gp)，又称多药耐药蛋白。p-gp可减少药物蓄积，然而过量表达的p-gp蛋白会导致细胞对多种抗癌药物产生耐药性，严重影响抗肿瘤药物的治疗效果。在肿瘤化疗中，化疗前abcb1 mrna高表达的肿瘤，化疗后高表达的肿瘤复发率较高，化疗效果往往不理想。在癌症患者的细胞中，abcb1 mrna的表达量也远高于健康者。然而abcb1高表达会引起的多药耐药，是恶性肿瘤化疗治疗中的一个重要瓶颈。

3、核酸提取是rt-pcr检测的基础，而细胞裂解液中的成分较为复杂，常用的核酸提取方法trizol法耗时长，且使用氯仿等有机试剂容易造成环境污染。提取核酸时要注意简化步骤，缩短提取时间；减少化学因素对核酸的降解；减少物理因素对核酸的降解；防止核酸的生物降解。完整且洁净的核酸有利于后续的rt-pcr扩增检测，因此一种快速，简便的核酸富集提取的手段具有良好的应用前景。

4、目前普遍的mrna检测技术有northen blot法、rna酶保护法、mrna原位杂交及逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)等。northen blot不需要大型仪器，实验成本低，但是检测灵敏度和特异性不强，且操作复杂样品容易降解；rna酶保护法需要同位素标记探针，探针制备复杂需要放射性材料的使用具有安全隐患；原位杂交技术容易受到rna酶的污染，特异性较低。逆转录聚合酶链式反应相较于其他几种方法具有宽的线性范围和极高的灵敏度，但是，rt-qpcr对引物的要求很高，通过设计特异性引物进行检测可有效提高检测的效率，避免假阳性的产生。

5、由金属离子和有机配体组成的多功能结构和可控功能的nmofs是生物成像和药物输送的研究热点。作为一种新兴的材料，纳米金属有机骨架(nanoscale metal–organicframeworks，nmof)具有良好的结构和独特的物理和化学性质，与传统的荧光纳米传感平台相比，nmofs的制备工艺更加简单。此外，nmofs可通过金属离子的配位和静电作用吸附核酸链，并且这些nmofs对单链的吸附能力要好于双链。通过离心法可以收集到核酸链与nmofs的复合材料，实现对mrna的富集作用，为核酸提取提供了更为简便的手段，有利于后续mrna的特异性检测。

6、因此，制造abcb1基因mrna的实时荧光定量pcr检测试剂盒具有重要意义，市场前景广阔。

技术实现思路

1、发明目的：为了解决上述问题，本发明实施例提供了一种用于富集并检测p-gp蛋白的abcb1基因mrna表达量的试剂盒。

2、技术方案：

3、一种快速提取并检测肿瘤高表达abcb1基因mrna的试剂盒，其特征在于，包括纳米金属有机骨架nmof、逆转录体系和荧光定量pcr反应体系；

4、其中：逆转录体系含有逆转录引物，其核苷酸序列为：5’-tctcaatctcatccatggtgaca-3’；

5、荧光定量pcr反应体系含有正向和反向qpcr引物和mgb探针；其中正向qpcr引物的核苷酸序列为：5’-gtgtggtgagtcaggaacctgtat-3’，反向qpcr引物的核苷酸序列为：5’-tctcaatctcatccatggtgaca-3’；mgb探针中的核苷酸序列为：5’-tgccaccacgatagc-3’。

6、所述的试剂盒，其特征在于，nmof为uio-66、mil-101、zif-8或cof。

7、所述的试剂盒，其特征在于所述uio-66由如下步骤制备获得：将200mg 1,4-对苯二甲酸溶解在2ml的dmf中，将42mg八水合氯氧化锆溶解在6ml的dmf中，将两种溶液混合在一起，加入4ml醋酸，得到的溶液放入反应釜中120℃孵育12h，形成纳米金属有机骨架uio-66。

8、所述的试剂盒，其特征在于，所述的逆转录体系由10mm dntps 1μl，40u/μlrnase酶抑制剂1μl，5u/μl m-mlv逆转录酶1μl，10×rt buffer 4μl，10μm逆转录引物引物2μl构成；

9、所述的荧光定量pcr反应体系包括，qpcrmix 10μl，10μm正向引物0.6μl，10μm反向引物0.6μl，10μm mgb探针0.4μl。

10、所述的试剂盒的检查方法，其特征在于：

11、(1)、nmof与目标mrna逆转录引物的组装条：取10μl nmof材料，加入2μl10μm的特异性逆转录引物，室温孵育10～20min后离心，去掉上清液，得到nmof材料与目标mrna逆转录引物的复合物；

12、(2)、mrna的逆转录：将步骤(1)获得的复合物加入1μg的细胞裂解液，在4℃冰箱中孵育10～20min后离心，去沉淀部分进行逆转录得到cdna；其中逆转录过程为：逆转录体系总体积为20μl，包括10mm dntps 1μl，40u/μl rnase酶抑制剂1μl，5u/μl m-mlv逆转录酶1μl，10×rt buffer 4μl，10μm逆转录引物2μl，模板mrna质量1μg，用depc水补充总体积至20μl；逆转录反应条件如下：50℃15min；85℃2min。

13、(3)荧光定量pcr反应：所述的荧光定量pcr反应体系总体积为20μl，包括，qpcrmix 10μl，10μm正向引物0.6μl，10μm反向引物0.6μl，10μm mgb探针0.4μl，步骤(3)获得的ds-cdna 2μl，用depc水补充总体积至20μl；所述的qpcr反应条件如下：扩增段条件为37℃120s；95℃30s；95℃10s；60℃30s共45个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

14、nmof浓度范围是：0.25mg/ml～10mg/ml

15、mrna逆转录引物的浓度范围是：0.1μm～10μm。

16、nmof与mrna逆转录引物的组装温度范围是：4℃～30℃

17、nmof与mrna逆转录引物的组装时间是：2min～30min

18、纳米金属有机骨架uio-66可以对细胞或细胞裂解液进行核酸提取，具体如下：

19、a：直接与细胞总rna结合:将uio-66与基因特异性逆转录引物充分混合均匀后，加入到核酸提取预分装试剂盒中，然后加入肝癌细胞总rna样本，进行提取，完成后将纯净的核酸模板加入到rt-qpcr试剂盒中进行后续实验；

20、b：与细胞裂解液结合：细胞破碎后，获得细胞裂解液进行核酸提取：将uio-66与基因特异性逆转录引物充分混合均匀后，加入到核酸提取预分装试剂盒中，然后加入肝癌细胞裂解液样本，进行提取，完成后将纯净的核酸模板加入到rt-pcr试剂盒中进行扩增实验；

21、本发明所提供的特异性引物是根据肿瘤外排蛋白p-gp的abcb1基因mrna的保守区域设计的，用于逆转录abcb1 mrna和定量检测abcb1 mrna的核酸拷贝数。

22、本发明通过扩增条件优化，体系配比调试，特异性和灵敏度试验，建立了检测abcb1基因mrna的方法。通过计算机和分析软件实现qpcr扩增、产物检测和定量分析一体化,最低检出量为3.9×104copies/μl。

23、本发明原理：

24、如图11所示，与传统pcr试剂盒不同，本发明采用纳米金属有机骨架uio-66进行rna提取，纳米金属有机骨架uio-66可通过金属离子的配位和静电作用吸附核酸链且uio-66对单链的吸附能力要好于双链，通过离心收集到核酸链与uio-66的复合物，实现单链的mrna在uio-66表面富集，逆转录反应发生在uio-66表面，形成ds-cdna后从uio-66表面脱落，进行后续的pcr扩增。

25、有益效果

26、与现有的技术相比，本发明具有如下显著的特点：

27、(1)本发明提供了一种快速，简便且环保的核酸富集手段，有助于核酸的特异性检测。

28、(2)本发明利用uio-66富集核酸，无要大型仪器且不使用有机溶剂，提取成本低并且没有化学试剂污染。可直接从细胞裂解液中富集所需核酸，耗时短，操作简便，不易使rna降解。并可特异性的富集靶标mrna，提高了反应的特异性。

29、(3)本发明针对在肿瘤细胞中高表达的abcb1 mrna的保守区设计出特异性引物，可在逆转录获得特异性目标ds-cdna，与传统逆转录得到的cdna文库相比，特异性强，灵敏度高。

30、(4)本发明通过扩增条件优化，体系配比调试，特异性和灵敏度试验，建立了abcb1mrna的实时荧光rt-qpcr检测方法，可用于血液、血清、血浆、组织中的abcb1 mrna的检测，检测灵敏度好，检测限为1.4×10-2copies/μl。