鸡马立克病毒的引物探针组及试剂盒与检测方法和应用与流程

本技术涉及检测鸡马立克病毒cvi988疫苗株与血清ⅰ型野毒株检测，本技术尤其涉及一种鸡马立克病毒的引物探针组及试剂盒与检测方法和应用。

背景技术：

1、马立克氏病(marker’s disease,md)是马立克氏病毒(marker’s disease virus,mdv)感染引起的一种高度传染性、淋巴细胞增生性疾病，主要特点是各外周神经、内脏器官组织、性腺和虹膜等出现淋巴细胞浸润和肿瘤病灶。根据病毒的血清学反应，分为三个血清型，即mdv血清ⅰ型、mdv血清ⅱ型和mdv血清ⅲ型，仅血清型ⅰ型感染鸡。

2、目前，检测mdv的方法包括使用鸡胚胎成纤维细胞(cef)进行病毒的分离培养、病理组织学切片观察淋巴瘤细胞浸润、琼脂扩散试验(agar gel precipitation，agp)以及聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)。然而，病毒的分离培养和鉴定所需周期较长，并且影响因素较多；agp灵敏度较低、易出现假阳性；普通pcr耗时长；而现有技术中荧光pcr检测试剂盒虽然能够检出阳性样品，但需要进行测序才能区分毒株基因型，检测时间长达3～5天，过程复杂，成本高，不符合快速大量检测原则。

技术实现思路

1、为了解决上述至少一种技术问题，建立一种操作简单、灵敏度高、特异性强以及能够实现检测鸡马立克氏病毒且能区分毒株基因型的目的，本技术提供一种检测鸡马立克病毒的引物探针组及试剂盒与检测方法和应用。

2、第一方面，本技术提供一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组，所述引物探针组包括用于检测鸡马立克病毒血清ⅰ型野毒株的引物探针组和用于检测鸡马立克病毒cvi988疫苗株的荧光探针mdv-p；

3、所述用于检测鸡马立克病毒血清ⅰ型野毒株的引物探针组包括上游引物mdv-wf、下游引物mdv-wr以及荧光探针mdv-wp；

4、其中，所述上游引物mdv-wf基因序列如seq id no.1所示；

5、所述下游引物mdv-wr基因序列如seq id no.2所示；

6、所述荧光探针mdv-wp基因序列如seq id no.3所示；

7、所述荧光探针mdv-p基因序列如seq id no.4所示；

8、所述荧光探针mdv-wp和荧光探针mdv-p基因序列中，5'端方向末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带不同的荧光报告基团；3'端方向一侧末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带非荧光淬灭基团。

9、通过采用上述技术方案，本技术提高了检测精确度。

10、可选的，所述荧光探针mdv-wp基因序列中，5'端方向末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的荧光报告基团为vic，3'端方向一侧末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的非荧光淬灭基团为mgb；荧光探针mdv-p基因序列中，5'端方向末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的荧光报告基团为fam，3'端方向一侧末端连接的鸟嘌呤脱氧核苷酸携带的荧光淬灭基团为mgb。

11、第二方面，本技术提供一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组在生物检测领域以及制备检测产品领域的应用。

12、第三方面，本技术提供一种用于检测鸡马立克病毒的检测试剂盒，所述试剂盒装载pcr组合物和阳性对照品；

13、所述pcr组合物包括本技术所述的用于检测鸡马立克病毒的引物探针组；

14、所述阳性对照品包括鸡马立克病毒血清ⅰ型野毒株的阳性质粒和鸡马立克病毒cvi988疫苗株的阳性质粒。

15、通过采用上述技术方案，本技术降低了检测成本、提高了检测精确度、同时达到了操作简便的效果。其机理在于：本技术通过提供一种实时荧光pcr检测鸡马立克病毒的检测试剂盒，不仅解决了现有技术中病毒的分离培养方法、普通pcr方法中存在的检测周期较长的问题，同时解决了现有技术中存在的检测精确度不高、灵敏度较低且易出现假阳性的问题，具有成本低、操作简便、灵敏度高以及检测精确度高的优势。

16、可选的，所述pcr组合物还包括酶混合液。

17、可选的，所述酶混合液(qprobe qpcr mix)包括pcr酶、dntp mixture、mg2+以及无核酸酶水。

18、可选的，所述pcr组合物中seq id no.1终浓度为0.15～0.45μm、seq id no.2终浓度为0.15～0.45μm、seq id no.3终浓度为0.15～0.45μm以及seq id no.4终浓度为0.15～0.45μm。

19、优选的，所述pcr组合物中seq id no.1终浓度为0.25μm、seq id no.2终浓度为0.25μm、seq id no.3终浓度为0.25μm以及seq id no.4终浓度为0.25μm。

20、第四方面，本技术提供一种检测鸡马立克病毒的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

21、s1、提取样本中的基因组dna；

22、s2、将提取后的基因组dna浓度稀释，并进行荧光pcr扩增反应；

23、s3、荧光pcr扩增反应结束后，根据pcr扩增的结果进行判读，得出鸡马立克病毒具体型别；

24、其中，所述pcr扩增反应包括本技术所述一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组。

25、通过采用上述技术方案，本技术通过优化检测鸡马立克病毒的扩增反应条件，提高了检测精确度。同时本技术所选择的用于检测鸡马立克病毒的引物探针组特异性强，结果易于判读，对仪器的要求不高，并且整个pcr过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，使结果更加精准。

26、可选的，所述荧光pcr扩增反应所需的反应条件为如下：95℃3min；95℃5sec，60℃30sec，40个循环，收集荧光信号。

27、可选的，所述结果判读依据为如下：

28、鉴别鸡马立克病毒血清ⅰ型野毒株的判读标准：根据pcr扩增的结果进行判读时，若检测在vic通道中出现特异性扩增曲线，则判定待测样本携带鸡马立克病毒血清ⅰ型野毒株；鉴别鸡马立克病毒cvi988疫苗株的判读标准：根据pcr扩增的结果进行判读时，若检测在fam通道中出现特异性扩增曲线，则判定待测样本携带鸡马立克病毒cvi988疫苗株。

29、综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：

30、1.本技术提供的一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组，具有特异性强的特点。

31、2.本技术提供的一种用于检测鸡马立克病毒的引物探针组能够实现鉴别鸡马立克病毒血清ⅰ型野毒株与鸡马立克病毒cvi988疫苗株的效果。因此，鸡马立克病毒的引物探针组可用于制备鸡马立克病毒的检测产品。

32、3.本技术提供的一种用于检测鸡马立克病毒的检测试剂盒能够克服现有技术中存在的成本高、操作复杂、周期长等问题，具有成本低、操作简便、检测时间短等优势。

33、4.本技术通过优化检测鸡马立克病毒的扩增反应条件，提高了检测精确度。同时本技术所选择的引物探针组特异性强，结果易于判读，对仪器的要求不高，并且整个pcr过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，使检测结果更加精准。