红系祖细胞的扩增培养基、扩增培养方法及应用

本发明涉及红系祖细胞体外培养及红系相关疾病治疗药物，尤其涉及红系祖细胞的扩增培养基、扩增培养方法及应用。

背景技术：

1、红细胞是血液中含量最丰富的一类细胞，它为人体所有组织和细胞提供所需的氧气。红细胞的生成是从造血干细胞逐步发育分化形成红细胞的过程。体外红系祖细胞的培养是研究红细胞生成调控，红细胞相关疾病及体外红细胞制备中必不可少的一部分。体外红系祖细胞培养需要多种生长因子的参与，然而，目前常用的一些生长因子作用都是有限的，仍寻找其他可刺激红系祖细胞增殖的化学分子。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于一种红系祖细胞的扩增培养基、扩增培养方法及应用），以期至少在一定程度解决上述技术问题。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、作为本发明的一个方面，提供了一种红系祖细胞的扩增培养基，包括n6-甲基-2’-脱氧腺苷（n6-methyl-2’-deoxyadenosine，6mda，cas: 2002-35-9），具有如下式所示结构：

4、

5、根据本发明的实施例，通过添加6mda，可通过维持红系祖细胞中c-kit（即cd117，ⅲ型受体酪氨酸激酶）的激活来促进增殖。

6、根据本发明的实施例，在扩增培养基中，6mda的浓度在5-200 mm范围内，在合适浓度范围内，6mda可更有效地刺激包括胎肝来源或成体骨髓来源红系祖细胞的增殖。

7、根据本发明的实施例，扩增培养基还包括基础培养基、l-谷氨酰胺、硫代甘油、糖皮质激素、促红细胞生成素（erythropoietin, epo）和干细胞生长因子（stem cellfactor, scf）。

8、根据本发明的实施例，l-谷氨酰胺可以为红系祖细胞提供所需的营养，促进红系祖细胞的增殖；作为优选，l-谷氨酰胺的浓度为2~4 mm，例如可以是2 mm、2.5 mm、3.5 mm、4mm等。

9、根据本发明的实施例，硫代甘油作为一种还原剂，来在细胞增殖中，通过抗氧化作用来维持细胞生长；作为优选，硫代甘油的浓度为50~100 μm，例如可以是50 μm、60 μm、70μm、80 μm、90 μm、100 μm。

10、根据本发明的实施例，糖皮质激素、epo和scf分别是体外红系祖细胞增殖刺激因子，能够刺激红系祖细胞的增殖。糖皮质激素包括但不限于帕拉米松、地塞米松等，优选为地塞米松（dexamethasone, dex），可增强scf的增殖作用。

11、根据本发明的实施例，在扩增培养基中，糖皮质激素的浓度为0.1~1 μm，例如可以是0.1 μm、0.2 μm、0.4 μm、0.6 μm、0.8 μm、1 μm等。在合适的浓度范围内，可以有效地刺激红系祖细胞的增殖。

12、根据本发明的实施例，在扩增培养基中，epo的浓度为0.5~1 u/ml，例如可以是0.5u/ml、0.6 u/ml、0.7 u/ml、0.8 u/ml、0.9 u/ml、1.0 u/ml等。在合适的浓度范围内，可以有效地刺激红系祖细胞的增殖。

13、根据本发明的实施例，在扩增培养基中，scf的浓度为10~100 ng/ml，例如可以是10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、80 ng/ml、100 ng/ml等。在合适的浓度范围内，可以有效地刺激红系祖细胞的增殖。

14、根据本发明的实施例，基础培养基为添加1x nutrient补充剂的stempro-34培养基。但并不局限于此，例如还可以是imdm培养基等。

15、作为本发明的另一个方面，提供了一种红系祖细胞的扩增培养方法，包括：使用如上所述的扩增培养基对红系祖细胞进行培养，以促进红系祖细胞的增殖。

16、根据本发明的实施例，红系祖细胞可以采用常规培养条件，例如可以采用37℃、5%co2的培养条件下培养红系祖细胞。

17、根据本发明的实施例，红系祖细胞来源于小鼠胚胎或骨髓，但并不局限于此，红系祖细胞还可以是人红系祖细胞等。

18、根据本发明的实施例，红系祖细胞为早期红系祖细胞bfu-e（红系爆式集落），6mda可促进早期红系祖细胞bfu-e的增殖。体外扩增10天能将其扩增能力提高10倍左右。

19、作为本发明的再一个方面，提供了一种n6-甲基-2’-脱氧腺苷在用于红系祖细胞的扩增培养中的应用。

20、作为本发明的又一个方面，提供了一种n6-甲基-2’-脱氧腺苷在制备用于治疗红系相关疾病的药物中的应用。

21、根据本发明的实施例，在体外培养红系祖细胞时添加6mda，可通过维持c-kit的激活来促进增殖，并且，6mda对c-kit的作用并没有产生不可逆的影响，经过6mda刺激增殖的红系祖细胞可正常分化，产生成熟的红细胞。在对这些由6mda诱导增殖的红系祖细胞诱导分化前去除6mda后，这些红系祖细胞可正常进入末端分化并产生血红蛋白。

22、总的来说，刺激红系祖细胞增殖的化学分子6mda，可用于红系祖细胞体外长期培养，由此可获得更多具有正常分化能力的红系祖细胞。

技术特征：

1.一种红系祖细胞的扩增培养基，包括n6-甲基-2’-脱氧腺苷。

2. 根据权利要求1所述的扩增培养基，其特征在于，n6-甲基-2’-脱氧腺苷的浓度为5~200 μm。

3.根据权利要求1所述的扩增培养基，其特征在于，所述扩增培养基还包括：基础培养基、l-谷氨酰胺、硫代甘油、糖皮质激素、促红细胞生成素和干细胞生长因子。

4. 根据权利要求3所述的扩增培养基，其特征在于，在所述扩增培养基中，l-谷氨酰胺的浓度为2~4 mm；硫代甘油的浓度为50~100 μm；糖皮质激素的浓度为0.1~1 μm；促红细胞生成素的浓度为0.5~1 u/ml；干细胞生长因子的浓度为10~100 ng/ml。

5.根据权利要求1所述的扩增培养基，其特征在于，所述基础培养基为添加1xnutrient补充剂的stempro-34；所述糖皮质激素为地塞米松。

6.一种红系祖细胞的扩增培养方法，包括：使用如权利要求1至5中任一项所述的扩增培养基对红系祖细胞进行培养，以促进所述红系祖细胞的增殖。

7.根据权利要求6所述的扩增培养方法，其特征在于，所述红系祖细胞来源于小鼠胎肝或骨髓。

8.根据权利要求6所述的扩增培养方法，其特征在于，所述红系祖细胞为人红系祖细胞。

9.一种n6-甲基-2’-脱氧腺苷在用于红系祖细胞的扩增培养中的应用。

10.一种n6-甲基-2’-脱氧腺苷在制备用于治疗红系相关疾病的药物中的应用。

技术总结
一种红系祖细胞的扩增培养基、扩增培养方法及应用，该扩增培养基包括N6‑甲基‑2’‑脱氧腺苷，可刺激多种来源红系祖细胞（包括胎肝及骨髓来源）的增殖，尤其可将早期红系祖细胞BFU‑E的增殖提高10倍左右。且这些增殖的红系祖细胞可正常分化产生成熟的红细胞。该分子可用于红系祖细胞的体外培养，以及红系祖细胞缺乏相关疾病的治疗。

技术研发人员：汪海林,李瑶
受保护的技术使用者：中国科学院生态环境研究中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13