抗-人epo受体的抗体及使用方法
【专利摘要】本文报道了一种抗体，所述抗体特异性结合人EPO受体，其中所述抗体结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQ?ID?NO：01)，但是所述抗体不特异性结合分子量为约66kD的可获自人内皮细胞的蛋白质。
【专利说明】抗-人EPO受体的抗体及使用方法
发明领域
[0001]本发明涉及抗-人EPO受体的抗体及其使用方法。
[0002]背景
[0003]人红细胞生成素(erythropoietin,ΕΡ0)是166个氨基酸的糖蛋白，其参与红系祖细胞的增殖和分化。这些细胞反应由人EPO受体(EPO receptor,EP0R)介导，人EPO受体是508个氨基酸的糖蛋白。EPO受体是长度为508个氨基酸的蛋白质(Swiss Prot P19235)，其包含单个跨膜结构域并且已被归类为I类细胞因子受体生长激素亚家族的成员。EPO受体描述于例如，ffinkelmann, J.C.等，Blood (血液)76 (1990) 24-30,和 Jones, S.S.等，Blood (血液)76 (1990) 31—35)。
[0004]从例如以下文献中针对EPO受体的抗体是已知的:D’ Andrea, A.D.，Blood(血液)82 (1993) 46-52 ；Elliott, S.，Bloodl07 (2006) 1892—1895 ；Kirkeby, A.，J.Neurosc1.Methodsl64 (2007) 50-58 ；Miura, 0.，Arch.Biochem.306 (1993) 200-208 ；Mayeux, P.等，J.Biol.Chem.266 (1991) 23380-23385 ；ffestphal.G.等，Clin.Exp.Med.2 (2002) 45—52 ；Elliott, S.等，J.1mmunol.Meth.352(2010) 126—139，以及 EP1146056、EP1327681、EP0773962、EP0776370、US2002 / 0031806、US2003 / 0215444、US2004 / 0058393、US2004 / 0071694、US2004 / 0175379、US2005 / 0227289、US2005 / 0244409、US2006 /0018902、US6, 153，190、US6, 998，124、US7, 053，184、US7, 081，523、W01995 / 005469、W01996 / 003438、W02000 / 061637、W02004 / 035603、W02005 / 100403 和 W02010 /022924。然而，由于已知抗体对EPO受体缺少特异性，调查EPO受体在组织样品中表达和定位的研究产生有分歧的和通常人为的结果(见，Jelkmann, W.等，Crit.Rev.0ne.Hematol.67(2008)39-61 ；Elliott, S.等，Bloodl07 (2006) 1892—1895 Jelkmann,ff.和 Laugsch，Μ.，J.Clin.0ncol.25(2007) 1627—1628 ;Kirkeby，A.等，J.Neurosc1.Methodsl64(2007)50—58 ；Laugsch, M.等，Int.J.Ca`ncerl22 (2008) 1005—1011)，或据报道，研究采用具有可疑特异性的抗体，并且观察的意义是有争议的(Elliott，S.，见上文)。
[0005]概述
[0006]已经发现，本文所述的抗体特异性结合人EPO受体，并且不与存在于内皮细胞上/内的类似大小的蛋白质交叉反应，从而允许产生明确的检测结果。
[0007]如本文中所报道的一个方面是体外检测人EPO受体的方法，所述方法包括以下步骤:通过将样品与特异性结合人EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)的EPO受体的抗体温育，体外确定所述样品中人EPO受体的存在，由此体外检测人EPO受体，其中所述特异性结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)的EPO受体的抗体不特异性结合具有约58kD至约70kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。
[0008]在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体不特异性结合具有约66kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。
[0009]在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体以KT3M或更高的亲和力结合所述可获自人内皮细胞的蛋白质。[0010]在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
[0011]在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
[0012]在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体是结合人EPO受体的抗体片段。
[0013]如本文中所报道的一个方面是特异性结合人EPO受体的抗体，其特征在于所述抗体结合人EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)并且不特异性结合具有约58kD至约70kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。
[0014]在一个实施方案中，所述抗体的特征在于其不特异性结合具有约66kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。
[0015]在一个实施方案中，所述抗体的特征在于其以IO-3M或更高的亲和力结合所述可获自人内皮细胞的蛋白质。
[0016]在一个实施方案中,所述抗体的特征在于其是多克隆抗体或单克隆抗体。
[0017]在一个实施方案中，所述抗体的特征在于其是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
[0018]在一个实施方案中，所述抗体的特征在于其是结合人EPO受体的抗体片段。
[0019]如本文中所报道的一个方面是特异性结合人EPO受体并且可以用于如本文中所报道的方法的抗体。
·[0020]如本文中所报道的一个方面是特异性结合人EPO受体的抗体，其用于如本文中所报道的方法。
[0021]在一个实施方案中，所述抗体的特征在于所述抗体结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)并且不特异性结合具有约58kD至约70kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。
[0022]在一个实施方案中，所述抗体的特征在于其不特异性结合具有约66kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。
[0023]在一个实施方案中，所述抗体的特征在于其以KT3M或更高的亲和力结合所述可获自人内皮细胞的蛋白质。
[0024]在一个实施方案中，所述抗体的特征在于其是多克隆抗体或单克隆抗体。
[0025]在一个实施方案中，所述抗体的特征在于其是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
[0026]在一个实施方案中，所述抗体的特征在于其是结合人EPO受体的抗体片段。
[0027]如本文中所报道的一个方面是特异性结合人EPO受体的抗体在检测人EPO受体中的用途，其特征在于所述抗体结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)并且不特异性结合具有约58kD至约70kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。
[0028]在一个实施方案中，所述用途的特征在于所述抗体不特异性结合具有约66kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。
[0029]在一个实施方案中，所述用途的特征在于所述抗体以KT3M或更高的亲和力结合所述可获自人内皮细胞的蛋白质。
[0030]在一个实施方案中，所述用途的特征在于所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。[0031 ] 在一个实施方案中，所述用途的特征在于所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。[0032]在一个实施方案中，所述用途的特征在于所述抗体是结合人EPO受体的抗体片段。
[0033]如本文中所报道的一个方面是用于预测或确定患者对用于增加红细胞数目的药物的反应性的方法，所述方法包括
[0034]-通过将患者的样品与如本文中所报道的EPO受体的抗体体外温育并且体外确定所述抗体与所述样品的结合来体外确定人EPO受体在所述患者的癌细胞上的存在，
[0035]由此，人EPO受体在患者癌细胞上的存在指示患者对用于增加红细胞数目的药物的反应性。
[0036]在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体不特异性结合具有约58kD至约70kD分子量(在一个实施方案中，约66kD)的、可获自人内皮细胞的蛋白质。
[0037]在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体以KT3M或更高的亲和力结合所述可获自人内皮细胞的蛋白质。
[0038]在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
[0039]在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
[0040]在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体是结合人EPO受体的抗体片段。
[0041]本文中报道了这样的抗体，其特异性结合具有氨基酸序列LPGPGGSVDIV(SEQ IDNO:01)的人EPO受体片段并且不结合人内皮细胞。已经发现，这样的抗体可以通过以下方式获得:用具有氨基酸序列LDKWLLPRNPPSED`LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:02)的EPO受体片段免疫实验动物，并且之后将获自实验动物的抗体交叉吸附(即，选择)到具有氨基酸序列LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)的 EPO 受体片段。
[0042]如本文中所报道的一个方面是用于制备特异性结合人EPO受体的抗体的方法，所述方法包括以下步骤:
[0043]-用包含EPO 受体片段 LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV (SEQ ID NO:02)的多肽免疫动物，和
[0044]-选择结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQID NO:01)的抗体并且由此制备特异性结合人EPO受体的抗体。
[0045]在一个实施方案中，所述选择是通过将获自所述免疫的动物的抗体交叉吸附到固定的SEQ ID NO:01的EPO受体片段。
[0046]在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体不特异性结合具有约58kD至约70kD分子量(在一个实施方案中，约66kD)的、可获自人内皮细胞的蛋白质。
[0047]在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体以KT3M或更高的亲和力结合所述可获自人内皮细胞的蛋白质。
[0048]在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
[0049]在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
[0050]在一个实施方案中，所述方法的特征在于所述抗体是结合人EPO受体的抗体片段。[0051]如本文中所报道的一个方面是特异性结合人EPO受体的抗体，其中所述抗体结合EPO 受体片段 LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)。
[0052]在一个实施方案中，所述抗体对所述人EPO受体的亲和力为10_7M以下。在一个实施方案中，所述抗体对所述人EPO受体的亲和力为10-8Μ以下。在一个实施方案中，所述抗体对所述人EPO受体的亲和力为5χ10_9Μ以下。在一个实施方案中，所述抗体对所述人EPO受体的亲和力为2χ10_9Μ以下。在一个实施方案中，所述抗体对所述人EPO受体的亲和力为约1.8χ10_9Μ。在一个实施方案中，所述抗体对所述人EPO受体的亲和力为至少δχΙΟ,Μ。在一个实施方案中，所述抗体对所述人EPO受体的亲和力为至少约6.βχΙΟ,Μ。
[0053]在所有方面的一个实施方案中，所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
[0054]在所有方面的一个实施方案中，所述抗体是小鼠抗体，或大鼠抗体，或兔抗体，或仓鼠抗体，或绵羊抗体，或山羊抗体，或鸡抗体，或猴抗体，或猪抗体，或人抗体，或人源化抗体。在一个实施方案中，所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
[0055]在一个实施方案中，所述抗体是特异性结合人EPO受体的抗体片段。
[0056]如本文中所报道的一个方面是分离的核酸，其编码如本文中所报道的抗体。
[0057]如本文中所报道的一个方面是宿主细胞，其包含编码如本文中所报道的抗体的核酸。
[0058]如本文中所报道的一个方面是制备如本文中所报道的抗体的方法，所述方法包括培养如本文中所报道的宿主细胞从而制备所述抗体。
[0059]在一个实施方案中 ，所述方法包括以下步骤:从所述宿主细胞或培养基回收抗体。
[0060]在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在一个实施方案中，所述细胞是CHO细胞，或HEK细胞，或BHK细胞，或Sp2 / O细胞，或NSO细胞。
[0061]在一个实施方案中，细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞或芽孢杆菌(Bacillus)细胞。
[0062]如本文中所报道的一个方面是用于制备特异性结合人EPO受体的抗体的方法，所述方法包括以下步骤:
[0063]-用包含EPO 受体片段 LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV (SEQ ID NO:02)的多肽免疫动物，和
[0064]-选择结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQID NO:1)的抗体，和
[0065]由此生产特异性结合人EPO受体的抗体。
[0066]在一个实施方案中，所述方法包括以下额外步骤中的一个或多个:
[0067]-培养包含编码已被选择的抗体的核酸的细胞，和/或
[0068]-从细胞或培养基回收抗体。
[0069]如本文中所报道的一个方面是包含如本文中所报道的抗体和可检测的标记或细胞毒性剂的免疫缀合物。
[0070]如本文中所报道的一个方面是包含如本文中所报道的抗体和任选地药用载体的药物制剂。
[0071]如本文中所报道的一个方面是包含与可检测的标记缀合的如本文中所报道的抗体的诊断制剂。
[0072]如本文中所报道的一个方面是如本文中所报道的抗体，其用作药物。
[0073]如本文中所报道的一个方面是如本文中所报道的抗体，其用于治疗贫血。[0074]如本文中所报道的一个方面是如本文中所报道的抗体，其用于改变患者中的红细胞数目。
[0075]如本文中所报道的一个方面是如本文中所报道的抗体在制备药物中的用途。
[0076]在一个实施方案中，所述药物用于治疗贫血。
[0077]在一个实施方案中，所述药物用于改变患者中的红细胞数目。
[0078]如本文中所报道的一个方面是治疗患有贫血的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如本文中所报道的抗体用以改变/增加个体中的红细胞数目。
[0079]如本文中所报道的一个方面是改变个体中的红细胞数目的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如本文中所报道的抗体以改变个体中的红细胞数目。
[0080]如本文中所报道的一个方面是诊断试剂盒，其包含如本文中所报道的抗体。
[0081]如本文中所报道的一个方面是用于制备包含如本文中所报道的抗体的诊断试剂盒的方法。
[0082]如本文中所报道的一个方面是如本文中所报道的抗体在确定或分析人组织样品中的人EPO受体中的用途。
[0083]在所有方面的一个实施方案中，样品是人组织或人细胞的溶解产物。
[0084]在所有方面的一个实施方案中，所述样品是组织的切片，或新鲜组织的切片，或冷冻的组织，或冷冻的组织的 切片，或福尔马林固定的石蜡包埋的组织，或福尔马林固定的石蜡包埋的组织的切片。
[0085]在所有方面的一个实施方案中，所述分析通过免疫化学，免疫荧光法，或免疫组织化学进行。在一个实施方案中，所述分析通过蛋白质印迹或FACS或使用NIRF或PET的体内成像进行。
[0086]在所有方面的一个实施方案中，所述确定是通过将组织样品与如本文中所报道的抗体温育并检测所述抗体与所述组织样品的结合。
[0087]如本文中所报道的一个方面是用于预测或确定患者对用于增加红细胞数目的药物的反应性的方法，所述方法包括
[0088]-体外确定人EPO受体在患者癌细胞上的存在，和
[0089]-将人EPO受体在患者癌细胞上的存在与患者对用于增加红细胞数目的药物的反应性相关联。
[0090]如本文中所报道的一个方面是用于确定用于治疗癌症患者的用于增加红细胞数目的药物的剂量的方法，所述方法包括:
[0091]-体外确定人EPO受体在患者癌细胞上的存在，和
[0092]-当确定存在人EPO受体时，决定不施用或施用较低剂量的增加红细胞数目的药物，和
[0093]-当确定不存在人EPO受体时，决定施用一定剂量的增加红细胞数目的药物。
[0094]如本文中所报道的一个方面是用于预测或确定患者对用于增加红细胞数目的药物的反应性的方法，所述方法包括
[0095]-体外确定人EPO受体在患者癌细胞上的密度，
[0096]-将人EPO受体在患者癌细胞上的密度与患者对用于增加红细胞数目的药物的反应性相关联。[0097]如本文中所报道的一个方面是用于确定用于治疗癌症患者的用于增加红细胞数目的药物的剂量，所述方法包括:
[0098]-体外确定人EPO受体在患者癌细胞上的存在，和
[0099]-在人EPO受体存在的情况下，决定不施用或施用较低剂量的增加红细胞数目的药物，和
[0100]-在不存在人EPO受体的情况下，决定施用正常剂量的增加红细胞数目的药物。
[0101]在所有方面的一个实施方案中，确定人EPO受体在癌细胞上的存在或确定人EPO受体在癌细胞上的密度是通过将患者的组织样品与如本文中所报道的EPO受体的抗体体外温育并且在体外确定所述抗体与所述样品的结合。
[0102]在一个实施方案中，增加红细胞数目的药物是红细胞生成素。
[0103]附图简述
[0104]图1对来自wt-HELA、HELA-EP0R和UT-7细胞的溶解产物的蛋白质印迹分析。
[0105]图2对wt-HELA和HELA-EP0R细胞的免疫细胞化学分析:Α:ΕΡ0受体-GFP融合蛋白:示例的如本文中所报道的抗体。
[0106]图3对wt-HELA和HELA-EP0R细胞的免疫组织化学分析:A:野生型HELA细胞；B:EP0R-HELA。
[0107]图4对来自UT-7、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)和HMVEC细胞(人微血管内皮细胞)的溶解产物的蛋白质印迹分析。
[0108]序列简述
[0109]SEQ ID NO:01人EPO受体的片段，其具有氨基酸序列LPGPGGSVDIV。
[0110]SEQ ID NO:02人EPO受体的片段，其具有氨基酸序列LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV。
[0111]SEQ ID NO:03人EPO受体前体的氨基酸序列。
[0112]发明实施方案详述
[0113]1.定义
[0114]用于本文目的的“接纳体人构架”是包含获自人免疫球蛋白构架或如下所定义的人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“获自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以包含氨基酸序列的变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10以下，9以下，8以下，7以下，6以下，5以下，4以下，3以下，或2以下。在一些实施方案中，VL接纳体人构架的序列与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
[0115]“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(也作Kd或KD或平衡常数)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法(包括本文中所描述的那些)来测量。当确定多克隆抗体的亲和力时，亲和力也被称为“表观亲和力”。 用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案描述于以下。
[0116]术语“抗-人EPO受体的抗体”和“结合人EPO受体的抗体”是指能够以足够的亲和力结合SEQ ID NO:03的人EPO受体，从而使得所述抗体用作靶向人EPO受体的诊断和/或治疗剂。在一些实施方案中，结合人EPO受体的抗体具有≤1OnM, ≤1nM, ≤ 0.1nM,≤0.01nM，或≤0.001nM(例如，KT8M以下，例如，KT8M至10_13M，例如，KT9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在一些实施方案中，抗-人EPO受体的抗体结合在来自不同物种的人EPO受体中保守的人EPO受体的表位。
[0117]术语"抗体"在本文中以最广义使用，并且包括不同抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们显示所需的抗原结合活性。
[0118]"抗体片段"是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab'，Fab’_SH，F(ab' )2 ；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv);和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0119]术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中一部分重链和/或轻链来源于特定来源或物种，而剩余的重链和/或轻链来源于不同来源或物种。
[0120]抗体的“类别”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五个主要类别的抗体:IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步被划分为亚类(同种型)，例如，IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，Y和μ。
[0121]术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于:放射性同位素(例如，At211，I131，I125，Y90, Re186，Re188，Sm153, Bi212, P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate),阿霉素(adriamicin),长春花生物喊(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine),依托泊苷(etoposide)),多柔比星(doxorubicin),美法仑(melphalan),丝裂霉素(mitomycin) C,苯丁酸氮芥(chlorambucil),柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；和下面公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
[0122]“效应子功能”指那些可归于抗体Fe区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括=Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC) ；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调jPB细胞活化。
[0123]试剂例如药物制剂的"有效量"是指在需要的剂量和时间阶段有效获得所需的治疗或预防结果的量。
[0124]术语“Fe区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fe区和可变Fe区。在一个实施方案中，人IgG重链Fe区从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fe区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fe区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为 EU 索引，如在 Kabat, E.A.等，Sequences ofProteins of ImmunologicalInterest (免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第5版，Public Health Service, NationalInstitutes ofHealth, Bethesda, MD(1991), NIH Publication91—3242 中所述。[0125]"构架"或"FR"是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成:FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常出现在VH(或 VL)的以下序列中:FR1—Hl(Ll)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
[0126]术语“全长抗体”、“完整的抗体”和“完整抗体”在本文被可交换地用于指结构与天然抗体结构基本相似或具有包含如本文所定义的Fe区的重链的抗体。
[0127]术语"宿主细胞"、"宿主细胞系"和"宿主细胞培养物"被可交换地使用并且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括"转化体"和"转化的细胞"，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。
[0128]“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0129]“人共有构架”是指这样的构架，即在选择人免疫球蛋白VL或VH构架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如Kabat，E.A.等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest (免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第五版，Bethesda MD(1991), NIH Publication91— 3242，卷 I一3 中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型κ I。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型III。
[0130]“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。
[0131]术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的每个区域，其序列高可变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)。通常，天然四链抗体包含六个HVR;三个在VH(HI，H2，H3)中，三个在VL(L1，L2，L3)中。HVR通常包含来自高变环和/或“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最闻序列可变性和/或涉及抗原识别。不例性闻变环发生在氣基酸残基26-32 (LI)，50—52 (L2) ,91—96 (L3)，26-32 (Hl)，53—55 (H2)，和 96 —101 (H3)。(Chothia,C.和 Lesk，A.M.,J.Mol.Biol.196 (1987) 901—917)。示例性 CDR(CDR_L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-Hl, CDR-H2，和 CDR-H3)发生在氨基酸残基 LI 的 24-34，L2 的 50-56，L3 的 89-97，Hl的 31—35B，H2 的 50-65，和 H3 的 95—102。(Kabat, E.A.等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest (免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第5版，Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991), NIH Publication91—3242)。除了 VH中的⑶Rl，⑶R通常包含形成高变环的氨基酸残基。⑶R还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是与抗原接触的残基。SDR包含在被称为缩短的(abbreviated)-OTR或 a-CDR 的 CDR 区域中。示例性 a-CDR(a_CDR-Ll， a_CDR_L2， a_CDR_L3， a-CDR-Hl，a-CDR-H2，和 a_CDR-H3)发生在氨基酸残基 LI 的 31 — 34，L2 的 50-55，L3 的 89-96，Hl 的31—35B, H2 的 50—58，和 H3 的 95—102。(见 Almagro，J.C.和 Fransson，J.，Front.Biosc1.13 (2008) 1619—1633)。除非另外说明，可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等(见上文)编号。
[0132]“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
[0133]“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
[0134]"分离的"抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95%或99%纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。为了回顾用于评估抗体纯度的方法，参见，例如，Flatman, S.等，J.Chromatogr.B848 (2007) 79-87。
[0135]"分离的"核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
[0136]“分离的编码抗-人EPO受体的抗体的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗体重和轻链(或其片段)，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。
[0137]术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能的变体抗体(该变体抗体例如含有天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂的过程中出现，此类变体通常少量存在)外，构成群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位。相比于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一`决定簇。因此，修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括但不限于杂交瘤法，重组DNA法，噬菌体展示法，和利用包含所有或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这样的方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法描述于本文中。
[0138]"天然抗体"是指天然存在的具有变化的结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻链和两个相同的重链组成，所述链通过二硫键结合。从N末端至C末端，每个重链具有可变区(VH)，其也被称为可变重结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N末端到C末端，每个轻链具有可变区(VL)，其也被称为可变轻结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被分配给被称为kappa (K)和lambda ( λ )的两个类型中的一个。
[0139]术语“可获自人内皮细胞”在全细胞的情况中表示多聚甲醛固定的过程，而在组织切片的情况中表示去石蜡过程之后，在柠檬酸缓冲液中在97°C进行45min的表位回收。
[0140]术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商品包装中的使用说明，其包含关于适应征、用法、剂量、给药、组合疗法、禁忌症的信息和/或关于使用这样的治疗产品的
敬生
目口 ο[0141]相对于参比多肽序列的“百分比)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为此目的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech，lnc，并且源代码已经随用户文档提交至美国版权局(Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可通过Genentech, Inc.(South San Francisco, California)得到 ALIGN-2 程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作系统、包括数字UNIXV4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比对参数并且不变。
[0142]在ALIGN-2应用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一'丨生(或者这样说:给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一 ％氨基酸序列同一性)如下计算:
[0143]100乘以X /Y比值
[0144]其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外具体说明，在本文用的所有％氨基酸序列同一性的值都是用ALIGN-2计算机程序如前段所描述的那样得到的。
[0145]术语“药物制剂”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施 用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
[0146]“药用载体”是指药物制剂中不同于活性成分的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0147]除非另外说明，术语“ΕΡ0受体”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然EPO受体。该术语包括“全长”未加工的人EPO受体以及由细胞内加工产生的任何形式的人EPO受体。该术语还包括人EPO受体的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位变体。示例性人EPO受体的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:03中。
[0148]术语“治疗(treatment)”(及其语法变化如“治疗(treat) ”或“treating”)指在尝试改变待治疗的个体的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减少疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和症状缓解或改善的预后。在一些实施方案中，将本发明的抗体用于延缓疾病的发生或减缓疾病的进展。
[0149]术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(VH和VL，分别地)的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt,T.J.等，Kuby Immunology,第 6 版，W.H.Freeman and C0., N.Y.(2007)91 页)。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano, S.等，J.1mmunol.150 (1993) 880-887 ；Clackson, T.等，Nature352(1991)624-628。
[0150]术语"载体"是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为"表达载体"。
[0151]I1.组合物和方法
[0152]在一方面中，本发明部分基于这样的发现，即特异性结合人EPO受体(尤其是SEQID NO:01的人EPO受体片段)的抗体，不显示与人上皮或内皮细胞交叉反应或交叉结合。在一些实施方案中，提供结合人EPO受体的抗体。本发明的抗体可以例如用于诊断或治疗贫血或癌症。本发明的抗体也可以用于在施用增加红细胞数目的药物之前(尤其是在施用红细胞生成素之前)给患者分层(stratification)。
[0153]A.示例的抗-人EPO受体的抗体
[0154]在一个方面中，本发明提供结合人EPO受体的分离的抗体。在一些实施方案中，抗-人EPO受体的抗体结合人EPO受体片段LPGPGGSVDIV(EpoR(361—371) ；SEQ ID NO:01)。
[0155]
【权利要求】
1.体外检测人EPO受体的方法，所述方法包括以下步骤: 通过将样品与特异性结合人EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)的EPO受体的抗体温育，体外确定所述样品中人EPO受体的存在，由此体外检测人EPO受体， 其中所述特异性结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)的EPO受体的抗体不特异性结合具有约66kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。
2.特异性结合人EPO受体的抗体，其特征在于所述抗体结合人EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)并且不特异性结合具有约66kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。
3.能够用于根据权利要求1所述的方法的特异性结合人EPO受体的抗体。
4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于所述抗体结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)并且不特异性结合具有约66kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。
5.特异性结合人EPO受体的抗体在检测人EPO受体中的用途，其特征在于所述抗体结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)并且不特异性结合具有约66kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。
6.预测或确定患者对增加红细胞数目的药物的反应性的方法，所述方法包括: -通过将所述患者的样品与权利要求2至4所述的EPO受体的抗体体外温育和体外确定权利要求2至4所述的抗体与所述样品的结合，体外确定人EPO受体在所述患者的癌细胞上的存在，和 -将人EPO受体在所述患者的·癌细胞上的存在与所述患者对增加红细胞数目的药物的反应性相关联。
7.用于制备特异性结合人EPO受体的抗体的方法，所述方法包括以下步骤: -用包含EPO受体片段LDKWLLPRNPPSEDLPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:02)的多肽免疫动物，和 -选择特异性结合EPO受体片段LPGPGGSVDIV(SEQ ID NO:01)的抗体并且由此制备特异性结合人EPO受体的抗体。
8.根据权利要求1或6或7所述的方法，根据权利要求2至4中任一项所述的抗体，或根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述抗体不特异性结合具有约58kD至约70kD分子量的可获自人内皮细胞的蛋白质。
9.根据权利要求1或6至8中任一项所述的方法，根据权利要求2至4或8中任一项所述的抗体，或根据权利要求5或8的用途，其特征在于所述抗体以IO-3M或更高的亲和力结合可获自人内皮细胞的蛋白质。
10.根据权利要求1或6至9中任一项所述的方法，根据权利要求2至4、8或9中任一项所述的抗体，或根据权利要求5或8或9所述的用途，其中所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
11.根据权利要求1或6至10中任一项所述的方法，根据权利要求2至4或8至10中任一项所述的抗体，或根据权利要求5或8至10中任一项所述的用途，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
12.根据权利要求1或6至11中任一项所述的方法，根据权利要求2至4或8至11中任一项所述的抗体，或根据权利要求5或8至11中任一项所述的用途，其中所述抗体是结合人EPO受体的抗体片段。
13.药物制剂，其包含权利要求2至4中任一项所述的抗体和药用载体。
14.分离的核酸，其编码根据权利要求2至4中任一项所述的抗体。
15.宿主细胞，其包含权利要求14所述的核酸。
16.诊断试剂盒，其包含根据权利要求2至4中任一项所述的抗体。
17.根据权利要求2至4中任一项所述的抗体在分析人组织或细胞样品中的EPO受体中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于所述样品是人组织或细胞的溶解产物，或人组织的切片，或新鲜人组织的切片，或冷冻的人组织，或冷冻的人组织的切片，或福尔马林固定的石蜡包埋的人组织，或福尔马林固定的石蜡包埋的人组织的切片。
19.根据权利要求17或18中任一项所述的用途，其特征在于所述分析通过免疫化学，免疫荧光或免疫组织化学进行。
20.根据权 利要求17至18中任一项所述的用途，其特征在于所述分析通过蛋白质印迹进行。
【文档编号】C07K16/28GK103596984SQ201280029140
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年6月14日 优先权日:2011年6月15日
【发明者】米夏埃多·雅尔施, 奥拉夫·蒙迪戈尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司