专利名称：：化学修饰的祖细胞生成素连接物的制作方法化学修饰的祖细胞生成素连接物发明领域本发明涉及重组蛋白家族的祖细胞生成素(progenipoietin)(ProGP)的化学修饰，祖细胞生成素是一个家族的重组蛋白，它们是fU3配体和其它造血生长因子受体，包括但不限制于G-CSF的多功能激动剂，通过〗务饰可改变ProGP的化学和/或生理性质。PEG化的ProGP可以具有降低的清除率，提高的稳定性，降低的抗原性，或其组合。ProGP蛋白家族被定义为多功能蛋白，它含有flt3受体激动剂和在WO98/17810中描述的笫二种造血生长因子或集落刺激因子受体激动剂，该专利文献整体引入此处作为参考。本发明还涉及修饰的ProGP的过程。此外，本发明还涉及含有修饰的ProGP的药物组合物。另一个实施方案是修饰的ProGP治疗造血疾病的用途。
背景技术：
：祖细胞生成素可用于治疗常见的造血疾病，包括由于化疗或放疗引起的那些(MacVittie，T.J.等，Exp.Hematol.(1999),27(10)，1557-1568)。ProGP还可用于骨髓移植，创伤愈合，烧伤的处理，和寄生虫，细菌或病毒感染的治疗。通常我们观察到给予机体的生理活性蛋白由于它们在机体内的高清除率而只能短期显示它们的药理活性。此外，这些蛋白的相对亲水性会限制它们的稳定性。为降低治疗性蛋白的清除率，提高它们的稳定性或消除它们的抗原性，人们已经提出了一些方法，其中用水溶性聚合物对蛋白进行化学修饰。这种类型的化学修饰可有效阻断蛋白水解酶与蛋白主链自身的物理接触，从而防止降解。化学连接可有效降低肾清除率。其它优点包括，在特定情况下，增加治疗性蛋白的稳定性和循环时间，增加溶解度，并降低免疫原性。描述蛋白修饰和融合蛋白的综述是Francis,FocusonGrowthFactors3:4_10(1992年5月)(Mediscript，MountviewCourt，FriernBarnetLane，LondonN20，OLD,UK出版)。6聚(环氧烷)，特别是聚(乙二醇)(PEG)就是这样一种化学部分，它可用于制备治疗性蛋白产品(动词"聚乙二醇化"是指与至少一个PEG分子连接)。聚(乙二醇)的连接已经显示出可防止蛋白水解，Sada等，J".FermentationBioengineering71:137-139(1991)，且用于连接某些聚(乙二醇)部分的方法是可获得的。见美国专利号US4，179，337，Davis等，"非免疫原性多肽，，，1979年12月18日发表；和美国专利号US4，002，531，Royer，"用聚乙二醇修饰酶以及由此产生的产物，，，1977年1月11日发表。综述见，Abuchowski等，EnzymesasDrugs.(J.S.Holcerberg和J.Roberts编辑，第367-383页(1981)。还使用过其它水溶性聚合物，如乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚(乙烯#)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(-l，3-二氧戊环)，聚(-1,3,6-三噁烷)，乙烯/马来酸酐共聚物，和聚-氨基酸(均聚物或无规共聚物)。人们已经描述过很多聚乙二醇化治疗性蛋白的例子。ADAGEN⑧，腺苷脱氨酶的聚乙二醇化制剂，已经被批准用于治疗重度联合免疫缺陷疾病。0NCASPAR⑧，一种聚乙二醇化的L-天门冬酰胺酶已经被批准用于治疗过敏的ALL患者。聚乙二醇化的超氧化物歧化酶已经在临床试验中用于治疗头部损伤。聚乙二醇化的ct-干扰素(US5，738，846,5，382，657)已经处于III期临床试验阶段，可与已被批准用于治疗慢性丙型肝炎的PEG-内含子(pegitronct-2b)联合治疗肝炎，而其它分子，PEGASYSTM正在等待管理机构的批准；据报道，聚乙二醇化的葡糖脑苷脂酶和聚乙二醇化的血红蛋白已经处于临床前期的试验中。其它例子是聚乙二醇化的IL-6，EF0442724，名称为'1务饰的hIL-6"，其中公开了将聚(乙二醇)分子添加到IL-6上。已被化学修饰的其它具体的治疗性蛋白是粒细胞集落刺激因子，(G-CSF)。G-CSF可诱导中性粒细胞迅速增殖并向血流释放，由此在抗感染方面提供治疗作用。1990年12月12日公开，名称为"化学修饰的粒细胞集落刺激因子，，的欧洲专利公开号EP0401384描述了用于制备与聚(乙二醇)分子连接的G-CSF的材料和方法。在1992年3月4日公开，名称为"含有与水溶性聚合物共价连接的多肽的持续释;故药物组合物"的EP0473268中也净艮道了^"饰的G-CSF及其类似物，其中还描述了与水溶性颗粒聚合物，如聚(乙二醇)共价连接的各种G-CSF和f汙生物的用途。在1989年10月4日/〉开的EP0335423中报道了具有人粒细胞集落刺激因子活性的修饰多肽。US5,824，784中提供了用于N-末端修饰蛋白的方法，包括N-末端化学修饰的G-CSF组合物。US5，824，778/^开了化学^务饰的G-CSF。日本专利申请Hei2(1990)-30555公开了抗原性降低的化学修饰的人IL-3。ProGP蛋白家族在W098/17810中/〉开。对于聚(乙二醇)而言，已经使用了各种方法使聚(乙二醇)分子与蛋白连接。通常，聚(乙二醇)分子是通过蛋白上的反应基团与蛋白连接的。氨基，如赖氨酸残基上或N-末端的那些适于这种连接。例如，Royer(美国专利号US4，002,531，上文)描述了利用还原烷基化连接聚(乙二醇)分子和酶。1993年4月28日/>开的EP0539167，Wright，"PegImidates及其蛋白衍生物"描述了PEG的imidate衍生物或相关水溶性有机聚合物修饰具有游离氨基的肽和有机化合物。Chamow等，BioconjugateChem.5:133-140(1994)净艮道了通过还原烷基化，用一曱氧基聚(乙二醇)醛修饰CD4免疫粘附素。作者还报道了有50%的CD4-Ig是在控制聚乙二醇化程度的条件下经MePEG修饰的。Ibid，第137页。该作者还报道了修饰的CD4-Ig(与蛋白gp120)的体外结合能力的降低速率与MePEG化的程度有关。Ibid.美国专利号US4,904,584，Shaw,1990年2月27日发表，涉及对蛋白中的一些赖氨酸残基进行修饰，从而经由反应性胺基与聚(乙二醇)分子连接。连接聚合物与蛋白的很多方法都包括使用起连接基团作用的部分。然而，这种部分可以是抗原性的。没有连接基团的tresyl氯化物方法也是可以使用的，但这种方法很难用于产生治疗性产物，这是因为tresyl氯化物的使用可产生有毒的副产物。见Francis等，蛋白药物的稳定性用于蛋白稳定的体内降解途径和策略(Eds.Ahern.T.和Manning,M.C.Plenum,NewYork,1991)。也见，Delgado等，"通过用tresyl氯化物活化而将PEG与蛋白偶联，在免疫亲和细胞制品中的应用"，^使用水相系统分离，在细胞生物学和生物工程中的应用，Fisher等编辑，Ple謹Press，NewYork,N.Y.，1989，第211-213页。还可见Rose等，BioconjugateChemistry2:154-159(1991)，其中报道了连接基团卡巴肼与蛋白底物(胰岛素)C-末端羧基的选择性连接。本发明提供具有降低的清除率，增加的稳定性，降低的抗原性，或其组合的化学《奮饰的ProGP分子。发明概述本发明涉及化学修饰的ProGP，它具有至少一种改进的化学或生理性质，所述化学或生理性质选自但不限制于降低的清除率，增加的稳定性，和降低的抗原性。因此，按照下面更详细的描述，本发明涉及有关化学修饰ProGP的很多方面，以及使用各种聚(乙二醇)部分进行的特定修饰。本发明还涉及生产化学修饰的ProGP的方法。本发明还涉及含有化学修饰的ProGP的组合物。本发明的修饰ProGP可用于治疗，但不限制于，嗜中性白细胞减少症，血小板减少症，造血祖细胞和干细胞向外周血中的动员，骨髓抑制或造血缺陷，以及免疫缺陷。附图简述图1是30,000MWPEG-ALDProGP-4反应的离子交换色谱洗脱图的再现。图2a是重组ProGP-4的SECHPLC图。图2b是30，000MWPEG-ALDProGP-4反应混合物的SECHPLC图。图2c是离子交换纯化的N-末端单-聚乙二醇化的30,000MWPEG-AU)ProGP-4的SECHPLC图。图3是30000MWPEG-ALDProGP-4的SDS-PAGE。第1道为MW蛋白标准品；第2道为空白组；第3道为ProGP-4;第4道为30，000MWPEG-ALDProGP-4。图4是离子交换纯化的N-末端单-聚乙二醇化的30，000MWPEG-ALDProGP-4的SDS-SECHPIX图。图5表示N-末端单-PEG化的30，000MWPEG-ALDProGP-4的反图6表示反相纯化的单体单-PEG化的30,OOOMWPEG-ALDProGP-4单体的MALDI-T0F光谱。图7表示单-PEG化的30,000MWPEG-ALDProGP-4胰蛋白酶消化的SECHPLC图。图8举例说明在粒细胞/巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)测定法中，flt3受体激动剂，G-CSF受体激动剂，flt3受体激动剂和G-CSF受体激动剂的共添加，未PEG化的ProGP-4和单-PEG化的30,000MWPEG-ALDProGP-4的反应曲线的比较，该测定法测量了来源于人骨髓的CD34+细胞的扩增和分化。图9举例说明ProGP-4和单-PEG化的30,000MWPEG-ALDProGP-4的鼠血浆浓度曲线的比较。图IO通过举例说明给药24小时后所获得的外周血和脾脏中的总白细胞(WBC)和树突细胞(DC)计数而比较了每天给予小鼠的未PEG化的ProGP-4和每三天给药的N-末端单-PEG化的30,000MWPEG-ALDProGP-4的体内生物活性。图11通过举例说明给药24，48和72小时后所获得的外周血和脾脏中的总白细胞(WBC)和树突细胞(DC)数而比较了每天给予小鼠的未PEG化的ProGP-4和每三天给药的N-末端单-PEG化的30，000MWPEG-AU)ProGP-4的体内DC反应动力学。图12表示ProGP-4的氨基酸序列。发明详述祖细胞生成素(ProGP)蛋白是重组蛋白家族的成员，它们是flt3配体和其它造血生长因子的多功能激动剂。它们的重组产生和使用方法在W098/17810中详细描述。祖细胞生成素蛋白的通式为R广L「R2，R广L广L，R广R2，R2—R!其中R!是含有下式的经修饰的fit-3配体氨基酸序列的多肽10130SEQ工DNO:1其中N-末端与C-末端直接连接，或通过能够连接N-末端和C-末端并分别在下列氨基酸位置具有新的C-和N-末端的连接体(LO连接28-2942-4393-9429-3064-6594-9530-3165-6695-9631-3266-6796-9732-3386-8797-9834-3587-8898-9936-3788-8999-10037-3889-90100-10138-3990-91101-10239-4091-92102-10340-4192-9341—42其中R2是选自集落刺激因子，细胞因子，淋巴因子，白介素和造血生长因子的因子；其中L是能够连接R!和R2的连接体。可任选直接在所述祖细胞生成素蛋白前面加上(曱硫氨酸—')，(丙氨酸—1)或(曱硫氨酸—2，丙氨酸爿)。在优选实施方案中，祖细胞生成素蛋白的通式为Ri一L广R2,R广L1-R1，R广R2，或R2—其中R,是含有下式的经修饰的fit-3配体氨基酸序列的多肽:102030405060LysThrValAlaGlySerLysMetGlnGlyLeuIjeuGluArgValAsnThrGluIleHis7080PheValThrLysCysAlaPheGlnProProProSerCysIieuArgPheValGlnThrAsn90100110120ArgGlnAsnPheSerArgCysLeuGluLeuGlnCysGlnProAsrSerSerThrlieu130SEQ工DNO:l其中N-末端与C-末端直接连接，或通过能够连接N-末端和C-末端并分别在下列氨基酸位置具有新的C-和N-末端的连接体(LO连接28-2942-4393-9429-3064-6594-9530-3165-6695-9631-3266-6796-9732-3386-8797-9834-3587-8898-9936-3788-8999-10037-3889_90100-10138-3990_91101-10239_4091-92102-10340-4192-9341—42其中R2是含有下式的修饰的人G-CSF氨基酸序列的多肽:110XaaXaaXaaGlyProAlaSerSerLeuProGinSerXaa20LeuLeuXaaXaaXaaGluGinValXaaLysXaaGinGlyXaaGly3040AlaXaaLeuGinGluXaaLeuXaaAlaThrTyrLysLeuXaaXaa50XaaGluXaaXaaValXaaXaaGlyHisSerXaaGlylieProTrp6070AlaProLeuSerSerXaaProSerXaaAlaLeuXaaLeuAlaGly80XaaLeuSerGinI>euHisSerGlyLeuPheLeuTyrGinGlyLeu90100LeuGinAlaLeuGluGly工leSerProGluLeuGlyProThrLeu110XaaThrLeuGinXaaAspValAlaAspPheAlaXaaThrlieTrp120130GinGinMetGluXaaXaaGlyMetAlaProAlaLeuGinProThr140GinGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaXaaGinXaaXaaAla150160GlyGlyValLeuValAlaSerXaaLeuGinXaaPheLeuXaaXaa170SerTyrArgValLeuXaaXaaLeuAlaGl:nProSEQIDN〇260l位的Xaa是Thr，Ser，Arg，Tyr或Gly;2位的Xaa是Pro或Leu;3位的Xaa是Leu,Arg，Tyr或Serj13位的Xaa是Phe，Ser，His,Thr或Proj16位的Xaa是Lys，Pro，Ser，Thr或Hisj17位的Xaa是Cys，Ser,Gly，Ala,Ile，Tyr或Argj18位的Xaa是Leu，Thr，Pro,His，Ile或Cys;22位的Xaa是Arg，Tyr，Ser，Thr或Alaj24位的Xaa是Ile，Pro,Tyr或Leuj27位的Xaa是Asp或Gly;30位的Xaa是Ala，lie,34位的Xaa是Lys或Ser36位的Xaa是Cys或Ser42位的Xaa是Cys或Ser43位的Xaa是His，Thr，或Leuj44位的Xaa是Pro，Gly，或Thr;46位的Xaa是Glu，Arg，47位的Xaa是Leu或Thr49位的Xaa是Leu，Phe，50位的Xaa是Leu，Ile，54位的Xaa是Leu或His64位的Xaa是Cys或Ser67位的Xaa是Gln，Lys，70位的Xaa是Gln，Pro,Leu或GlyjGly，Val，Lys，Trp，Ala，Arg，CysArg，Asp，Val，Ala,His,Trp，GlnPhe，Arg，Ile或Ala;Arg或Ser;His，Pro或TyrjLeu或CysjLeu，Arg或Ser;74位的Xaa是Cys或Ser;104位的Xaa是Asp,Gly或Val;108位的Xaa是Leu，Ala，Val，Arg，Trp，115位的Xaa是Thr，His,Leu或Ala'，120位的Xaa是Gln，Gly，Arg，I>ys或His123位的Xaa是Glu，Arg，Phe或Thr'，144位的Xaa是Phe，His,Arg，Pro,Leu，Gin或Gly;Gln或Glu;146位的Xaa是Arg或Gin;147位的Xaa是Arg或Gin;156位的Xaa是His，Gly或Ser;159位的Xaa是Ser，Arg，Thr，Tyr，Val或Glyj162位的Xaa是Glu，Leu，Gly或Trp;163位的Xaa是Val，Gly，Arg或Ala;169位的Xaa是Arg，Ser，Leu，Arg或Cysj170位的Xaa是His，Arg或Ser;其中N-末端l-ll位的氨基酸和/或C-末端1-5位的氨基酸任选从所述修饰的人G-CSF氨基酸序列中缺失；且其中N-末端与C-末端直接连接，或通过能够连接N-末端和C-末端并分别在下列氨基酸位置具有新的C-和N-末端的连接体(LO连接38-3962-63123-12439-4063-64124-12540-4164-65125-12641-4265-66126-12742-4366-67128-12943-4467-68128-12945-4668-69129-13048-4969-70130-13149-5070-71131-13252-5371-72132-13353-5491-92133-13454-5592-93134-13555-5693-94135-13656-5794-95136-13757-5895-96137-13858-5996-97138-13959-6097-98139-14060-6198-99140-14161-6299-100141-142或142-143;其中，Li是能够连接Ri和R2的连接体。在另一实施方案中，可任选直接在所述祖细胞生成素前面加上(甲硫氨酸")，(丙氨酸—')或(曱硫氨酸"，丙氨酸—1)。在优选实施方案中，R,选自SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7,SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12，SEQIDNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:15，SEQIDNO:16，SEQIDNO:17，SEQIDNO:18，SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDNO:21,SEQID歐22,SEQIDNO:23，SEQIDNO:24，SEQID歐25，SEQIDNO:26，SEQIDNO:27，SEQIDNO:28，SEQIDNO:29，SEQIDNO:30，SEQIDNO:31，SEQIDNO:169，SEQIDNO:170，SEQIDNO:171，SEQIDNO:172，SEQIDNO:173，SEQIDNO:174，和SEQIDNO:175。在优选实施方案中，IL是GM-CSF，G-CSF，G-CSFSer17，c-mpl配体(TPO)，M-CSF，红细胞生成素(EPO)，IL-1，IL-4，IL-2，IL-3，IL-3变体，IL-5，IL-6，IL—7，IL—8，IL—9，IL-IO，IL—11，IL-12，IL-13，IL-15，LIF，flt3/flk2配体，人生长激素，B-细胞生长因子，B-细胞分化因子，嗜酸性细胞分化因子和干细胞因子(SCF)。在优选实施方案中，祖细胞生成素蛋白选自SEQIDNO:32，SEQIDNO:33，SEQIDNO:34，SEQIDNO:35，SEQIDNO:36，SEQIDNO:37，SEQIDNO:38，SEQIDNO:39，SEQIDNO:40，SEQIDNO:41，SEQSEQIDNO:44,SEQIDNO:45，SEQIDNO:46，NO:48，SEQIDNO:49，SEQIDNO:50，SEQSEQIDNO:53，SEQIDNO:54，SEQIDNO:55，NO:57，SEQIDNO:58，SEQIDN0r59，SEQSEQIDNO:62，SEQIDNO:63，SEQIDNO:64，歐66，SEQIDNO:67，SEQIDNO:68，SEQSEQIDNO:71,SEQIDNO:72，SEQIDNO:73，NO:75,SEQIDNO:76，SEQIDNO:77，SEQSEQIDNO:80，SEQIDNO:81，SEQIDNO:82，NO:84，SEQIDNO:85，SEQIDNO:86，SEQSEQIDNO:89，SEQIDNO:90，SEQIDNO:91，歐93，SEQIDNO:94，SEQIDNO:95，SEQSEQID歐98，SEQIDNO:99，SEQIDNO:100,101，SEQIDNO:102，SEQIDNO:103，SEQIDNO:104，105,SEQIDNO:106,SEQIDNO:107,SEQIDNO:108,109，SEQIDNO:110，SEQIDNO:111，SEQIDNO:112，113，SEQIDNO:114，SEQIDNO:115，SEQIDNO:116，117,SEQIDNO:118，SEQIDNO:119，SEQIDNO:120，16IDNO:42，SEQIDNOSEQIDNO:47，SEQIDNO:51，SEQIDNOSEQIDNO:56，S&QIDNO:60，SEQIDNOSEQID麼65，SEQIDNO:69，SEQIDNOSEQIDNO:74，SEQIDNO:78，SEQIDNOSEQIDNOr83，SEQIDNO:87，SEQIDNOSEQIDNO:92，SEQIDNO:96，SEQIDNO:97SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO43,ID52:ID61:IDID79:ID88，ID<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>在优选实施方案中，连接体(LO选自Gly,'Thr;GlySer,'AlaAla;GlySerGly,'GlyGlyGlyGlyAsnGly,.GlyAlaGly;GlyThrGly,'AlaSerAla,'AlaAlaAla,-GlyGlyGlySerSEQIDNO:231,'GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerSEQ工DNO:232,-GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerSEQIDNO:233;SerGlyGlySerGlyGlySerSEQ工DNO:234;GluPheGlyAsnMetSEQIDNO:235/GluPheGlyGlyAsnMetSEQ工DNO:236;GluPheGlyGlyAsnGlyGlyAsnMetS:SQ工DNO:237,-GlyGlySerAspMetAlaGlySEQIDNO:238;SerGlyGlyAsnGlySEQIDNO:239;SerGlyGlyAsnGlySerGlyGlyAsnGlySEQIDNO:240;SerGlyGlyAsnGlySerGlyGlyAsnGlySerGlyGlyAsnGlySEQIDNO:241,SerGlyGlySerGlySerGlyGlySerGlySEQIDNO:242;SerGlyGlySerGlySerGlyGlySerGlySerGlyGlySerGlySEQIDNO:243;GlyGlyGlySerGlyGlySEQ工DNO:244;GlyGlyGlySerGlyGlyGlySEQIDNO:245/GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlySEQIDNO:246/GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlySEQIDNO:247/GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySEQIDNO:248/GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlySEQIDNO:249,'ProP:roPt:oTrpSerProAxgPiroIjeuGlyAlaTh:rAlaP:roThrAlaGlyGlnProProLeuSEQIDNO:250;ProProProTrpSerProArgProIjeuGlyAlaThrAlaProThrSEG工DNO:251;SEQ工DNO:252;GlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlySerGluGlyGlyGlyGlyGlyGlySerSEQIDNO:253;SerLysGluSerHisIiysSerPro,-SEQ工DN〇254,和工leGluGlyArg工leSei:GluProSerGlyPro工leSei:Thr工leAsnProSerProProSerliysGluSerHisLysSerProSEQ工DN〇255.通过使用重组基因技术转化或转染的宿主细胞，如大肠埃希氏菌和动物细胞产生的任何纯化和分离的ProGP都可用于本发明中。在它们之中，通过转化的大肠埃希氏菌产生的ProGP是特别优选的。这种ProGP可以较高的纯度和均质性大量获得。例如，上述ProGP可按照W098/17810中公开的方法制备。术语"基本上具有下列氨基酸序列"是指上述氨基酸序列可包括一个或多个氨基酸改变(缺失，加成，插入或置换)，只要这种改变不会对ProGP的功能造成任何不利的非相似性。更优选使用基本上所含氨基酸序列具有至少一个赖氨酸，天门冬氨酸，谷氨酸，或不成对的半胱氨酸残基的ProGP。根据本发明，聚(乙二醇)是通过ProGP的氨基酸残基共价连接的。所述氨基酸残基可以是任何反应基团，例如，具有可与活化的聚(乙二醇)的末端反应基团结合的游离氨基，羧基或巯基(硫醇)。具有游离氨基的氨基酸残基可以包括赖氨酸残基和/或N-末端氨基酸残基，具有游离羧基的那些可以包括天门冬氨酸，谷氨酸和/或C-末端氨基酸残基，和具有巯基(硫醇)，如半胱氨酸的那些。在另一实施方案中，8-羟基全啉化学(Lemieux&BertozziTibTech16:506-513，1998)可用于导向N-末端的丝氨酸残基。本发明所用的聚(乙二醇)不限制于任何特定的形式或分子量范围。通常，使用500-60，000，优选1,000-40，G00的分子量。所述聚(乙二醇)还可以是US5，932，462，US5,342,940，US5，643，575，US5,919,455，US6，113，906和US5，183，660中描述的支化PEG。聚(环氧烷)，特别是聚(乙二醇)是通过末端反应基团与ProGP结合的，它在PEG和蛋白之间可以留有或没有连接部分(间隔基团)。为了形成本发明的ProGP连接物，聚合物如聚(环氧烷)转化成"活化"形式。所述反应基团例如是末端反应基团，它可调节蛋白上的化学部分，如氨基，羧基或巯基，与聚(乙二醇)之间的键。通常，末端聚合物的羟基端基(即，ct和co末端鞋基)的其中一个或两个都转化成反应官能团，从而进行共价连接。该过程常常被称作"活化"，具有反应基团的聚(乙二醇)产物在下文中被称作"活化的聚(乙二醇)"。含有oc和co连接基团的聚合物被称作"双活化的聚(环氧烷)"及"双官能的"。在ct和co末端羟基上含有相同反应基团的聚合物有时被称作"同双官能的"或"同双活化的，，。在a和co末端羟基上含有不同反应基团的聚合物有时被称作"异双官能的，，或"异双活化的，，。含有单一反应基团的聚合物被称作"单活化的"聚环氧烷或"单官能的"。其它基本非抗原性的聚合物是类似"活化的"或"官能化的"。因此，活化的聚合物适于介导蛋白上的化学部分，如a-氨基，羧基或巯基，与聚(乙二醇)之间的键。在另一实施方案中，双活化的聚合物以这种方式，通过交联，与两个蛋白分子或一个蛋白分子以及反应性小分子反应，从而有效形成蛋白聚合物或蛋白-小分子连接物。能够与ProGP上的赖氨酸氨基末端的a-氨基或e-氨基反应的官能团包括碳酸酯，如对-硝基苯基，或琥珀酰亚胺基，羰基咪唑，氮杂内酯，环状亚胺硫酮，异氰酸酯，异硫氰酸酯和醛。能够与ProGP上的羧酸基团，反应性羰基和氧化的碳水化合物部分反应的官能团包括伯胺，以及肼和酰肼官能团，如酰肼，肼基曱酸酯，氨基甲酸酯(semicarbamate)，硫代肼基甲酸酯等。如果ProGP上存在巯基，那么它也可用作适当活化的聚合物与反应基团的连接位点，所述反应基团如硫醇，马来酰亚胺，砜，和苯甲酰曱醛。见，例如，美国专利号US5，093,531，它公开的内容引入此处作为参考。其它能够与亲电中心反应的亲核物质包括，但不限制于，例如羟基，氨基，羧基，巯基，活性亚曱基等。在本发明的优选实施方案中，仲胺或酰胺键是使用ProGP中赖氨酸的N-末端氨基或s-氨基与活化PEG形成的。在本发明另一优选方面，仲胺键是通过用适宜的还原剂，如NaCNBHs，NaBIL，吡咬硼烷等还原剂，在ProGP的N-末端伯氨基和单链或支链的PEG醛之间形成的，20如Chamow等，BioconjugateChem.5:133-140(1994)和美国专利号US5，824，784所述。在本发明另一优选实施方案中，用形成酰胺的连接体，如琥珀酰亚胺酯，环状亚胺硫酮等活化的聚合物可用于实现ProGP与聚合物之间的连接，见，例如，美国专利号US5,349,001;美国专利号US5,405,877;和Gree難ld等，Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.17:101-161，2000，其引入此处作为参考。优选的，可与ProGP的游离氨基结合的活化聚(乙二醇)包括单链或支链的N-羟基琥珀酰亚胺聚(乙二醇)，它是通过用N-羟基琥珀酰亚胺活化聚(乙二醇)的琥珀酸酯而制备的。本发明的其它优选实施方案包括使用其它活化聚合物，通过s-氨基或其它基团与ProGP形成聚合物的共价连接。例如，末端活化的聚合物的异氰酸酯或异硫氰酸酯形式可用于与赖氨酸的氨基形成以脲或基于硫脲的键。在本发明另一优选方面，氨基甲酸酯(尿烷)键是用蛋白的氨基形成的，如美国专利号US5，122，614，5，324，844，和5,612，640所述，它们都引入此处作为参考。例子包括N-琥珀酰亚胺基碳酸酯，对-硝基苯基碳酸酯，和羰基咪唑活化的聚合物。在本发明另一优选实施方案中，PEG的苯并三唑碳酸酯衍生物与ProGP上的氨基连接。本发明另一方面提供ProGP的前体药物或持续释放形式，它含有通过功能连接体与ProGP分子连接的水溶性聚合物，如聚(乙二醇)，该连接体可通过酶或pH直接水解预先断裂，从而释放游离ProGP或其它ProGP衍生物。所述前体药物还可以是涉及级联latentiation使用的"双前体药物，，(BundgaardinAdvancedDrugDeliveryReviews3:39-65，1989)。在这种系统中，水解反应包括最初的限速(緩慢的)酶或pH定向步骤，第二步包括快速的非-酶水解，它仅在第一步发生后出现。这种可释放聚合物提供的蛋白连接物是暂时的，可作为贮器持续释;^文ProGP。这种功能连接体在US5,614,549;US5,840,900;US5,880,131;US5，965，119;US6,011,042;US6,180,095Bl;Gree腿ldR.B.等，J.Med.Chem.42:3657-3667，1999;Lee，S.等，BioconjugateCheml2:163-169，2001;Ga簡nA.J.等，FEBSLett.223:361—365，1987;WoghirenC.等，BioconjugateChem.4:314—318，1993;RobertsM.J.等，J.Pharm.Sci.87:1440-1445，1998;ZhaoX-，NinthInt.Symp-RecentAdv.DrugDeliverySyst.199;Gree謹ldR.B.等，J.Med.Chem.43:475-487，2000;和Gree腿ldR.B.Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.l7:101-161，2000中描述。本发明另一实施方案是将PEG与亲核物质连接的方法，其中连接是在有无机溶剂存在的条件下进行的。"亲核物质，，被定义为蛋白，它包括但不限制于抗体和造血生长因子，肽，酶，医用化学品或有机部分。优选的无机溶剂是乙腈，曱醇，或乙醇。更优选的无机溶剂是乙腈。优选无机溶剂的浓度约为1%_25%，更优选约为3%-13%，更优选约8%。连接反应，也称作聚乙二醇化反应，通常是在有摩尔过量聚合物存在的溶夜中进行的，而不考虑聚合物在何处与蛋白连接。然而，这种通用技术一般已经被证实不足以在使生物活性蛋白与非抗原性聚合物连接的同时，又保留充足的生物活性。维持ProGP生物活性的其中一个方法是基本上避免那些与聚合物偶联过程中的受体结合位点有关的ProGP反应基团的连接。本发明另一方面提供一种使聚(乙二醇)与ProGP连接，同时又维持高水平的保留活性的方法。通过共价键进行的化学修饰可在通常生物活性物质与活化聚(乙二醇)的反应中所采用的任何适宜的条件下进行。所述连接反应是在相对温和的条件下进4亍的，从而避免将ProGP灭活。温和的条件包括维持反应溶液的pH值在3-10，维持反应温度在约0-37°C。在ProGP中的反应氨基酸残基具有游离氨基的情况下，上述修饰优选在4-37°C下，在下列非限制性的适宜緩冲液(pH3-10),包括磷酸盐，柠檬酸盐，醋酸盐，琥珀酸盐或HEPES中进行1-48小时。在使用试剂，如PEG醛导向于N-末端氨基的情况下，优选维持pH值在4-7。所用活化聚(乙二醇)的摩尔量为ProGP的游离氨基数的0.05-100倍，优选0.05-0.5倍。另一方面，在ProGP中的反应氨基酸残基具有游离羧基的情况下，上述修饰优选在约pH3.5-5.5的条件下进行的，例如，使用聚(氧化乙烯二胺)进行的修饰是于4-37°C，在有碳二亚胺(pH4-5)存在的条件下进行1-24小时。所用活化聚(乙二醇)的摩尔量为ProGP的游离羧基数的0.05-300倍。22在独立的实施方案中，连接反应中所用聚合物量的上限超过约1:1，从而使活化聚合物与ProGP反应，且不会形成大量高分子量种类，即，有超过约20。/。的连接物在每分子ProGP中含有不止约一条链的聚合物。例如，预期在本发明这方面，可使用多至约6:1的比例，从而形成大量所需连接物，然后将它们从高分子量种类中分离出来。在本发明另一方面中，双官能活化的PEG衍生物可用于产生聚合的ProGP-PEG分子，其中有多个ProGP分子经由PEG交联。虽然这里所述的反应条件可导致产生大量未修饰的ProGP，但未修饰的ProGP可很容易再循环到下一批中，用于进行另外的连接反应。令人惊奇的是，本发明的过程产生出非常少量的，即少于约30%，更优选少于约10%的高分子量种类以及每个ProGP含有不止一个聚合物链的种类。这些反应条件与聚合连接反应通常所用的那些相反，通常所用的条件下活化聚合物以超过目标若干倍的摩尔量存在。在本发明其它方面中，所存在聚合物的量约为ProGP的0.l-50倍。在本发明其它方面中，所存在聚合物的量约为每当量ProGP约1-10当量。本发明的连接反应最初提供一种反应混合物或合并物，其中含有单-和二-PEG-ProGP连接物，未反应的ProGP,未反应的聚合物和通常少于约20%的高分子量种类。所述高分子量种类包括含有不止一个聚合物链的连接物和/或聚合的PEG-ProGP种类。除去未反应的种类和高分子量种类后，回收主要含有单-和二-聚合物-ProGP连接物的组合物。已知绝大部分连接物都含有单一的聚合物链，因此所述连接物基本上是均匀的。通过使用标准细胞增殖测定法，如AML，TF1和集落形成单位测定法(美国专利US6，030，812，其引入此处作为参考)测量可知，这些修饰的ProGP具有至少约5%的体外生物活性，这种体外生物活性与天然或未修饰的ProGP有关。在本发明的优选方面，修饰的ProGP具有约25%的体外生物活性，更优选^f奮饰的ProGP具有约50%的体外生物活性，更优选修饰的ProGP具有约75%的体外生物活性，最优选修饰的ProGP具有相等或提高的体外生物活性。本发明的过程优选包括更有限的聚合物与ProGP比。因此，所述ProGP连接物主要被限制在仅含有一条聚合物链的种类。此外，当使用更高摩尔过量的聚合物连接体时，聚合物与ProGP反应基团的连接基本上不是随机的。在连接反应已经猝灭后，反应混合物中的未修饰ProGP可通过使用离子交换或大小排阻层析或类似的分离技术而再循环到后面的反应中。本发明聚(乙二醇)-修饰的ProGP，即化学修饰蛋白可通过用于纯化蛋白的常规方法，如透析，盐析，超滤，离子交换层析，凝胶层析和电泳而从反应混合物中纯化出来。离子交换层析对于除去未反应的聚(乙二醇)和ProGP特别有效。在本发明另一实施方案中，分离反应混合物中的单-和二-聚合物-ProGP种类，从而除去高分子量种类和未修饰的ProGP。分离是通过将混合的种类放在含有约0.5-10mg/mLProGP-聚合物连接物的緩冲溶液中进行的。适宜的溶液pH值约为4-10。该溶液优选含有选自KC1，NaCl，K2HP04，KH2P04，Na2HP04，NaEbPO"NaHC03，NaB04,CH3C02H和NaOH的一种或多种緩冲盐。根据反应緩冲液的不同，ProGP聚合物的连接物溶液可能首先必须经过緩冲液交换/超滤，从而除去所有未反应的聚合物。例如，可通过低分子量截止(10，000-30，000道尔顿)薄膜将PEG-ProGP连接物溶液超滤，从而除去绝大部分不需要的物质(如果存在)，如未反应的聚合物，表面活性剂等。连接物到含有所需种类的合并物的分级分离优选使用离子交换层析介质进行。这种介质能够通过电荷差异选择性结合PEG-ProGP连接物，而且它可以一定程度上可预测的形式改变。例如，ProGP的表面电荷是由蛋白表面上可获得的带电基团数决定的。这些带电基团通常可起到聚(环氧烷)连接物的潜在连接点的作用。因此，ProGP连接物具有与其它种类不同的电荷，从而可以进行选择性分离。本发明的方法可分别使用强极性的阴离子或阳离子交换树脂，如季胺或磺丙基树脂。特别优选阳离子交换树脂。适合本发明使用的市售阳离子交换树脂的非限制性例子是SP-hitrap，SPSepharoseHP和SPSepharosefastflow。其它适合的阳离子交换树脂，如S和CM树脂也可使用。适合本发明使用的阴离子交换树脂，包括市售阴离子交换树脂的非限制性例子是Q-hitrap,Q-SepharoseHP，和Qsepharosefastflow。其它适合的阴离子交换树脂，例如，DEAE树脂也可使用。例如，优选将阳离子交换树脂填充到柱子中，并用常规方法平衡。使用与聚合物连接的ProGP溶液具有相同pH值和相同重量克分子渗透浓度的緩冲液。所述洗脱緩冲液优选含有一种或多种选自KC1，NaCl，L訓4，KH2P04，Na2HP04，NaH2P04，NaHC03，NaB(h，和(NHO2C03的盐。然后，使含有连接物的溶液吸附到具有未反应聚合物，但没有保留某些高分子量种类的柱上。上样完成后，在柱上施加盐浓度逐渐增加的洗脱緩冲液梯度，从而将聚环氧烷连接的ProGP的所需级分洗脱下来。在阳离子交换分离步骤之后，优选洗脱下来的合并级分限制在均匀的聚合物连接物。然后，可通过常规技术将所有未连接的ProGP种类从柱子上洗脱下来。如果需要，可通过其它离子交换层析或大小排阻层析进一步将单和多聚乙二醇化的种类彼此分离开。也可利用逐渐增加浓度的多次恒溶剂洗脱步骤的技术。逐渐增加浓度的多次恒溶剂洗脱步骤可导致二-和单-ProGP-聚合物连接物的顺序洗脱。进行洗脱的温度范围约为4°C-25°C。优选洗脱是在约6'C-22r进行的。例如，PEG-ProGP级分的洗脱是通过280nm处的UV吸光度检测的。各级分的收集可通过简单的时间洗脱图获得。在使聚(乙二醇)聚合物与ProGP部分连接的过程中，可使用表面活性剂。适宜的表面活性剂包括离子型表面活性剂，如十二烷基硫酸钠(SDS)。其它离子型表面活性剂，如十二烷基硫酸锂，季铵化合物，牛磺胆酸，辛酸，癸烷磺酸等也可使用。还可使用非离子型表面活性剂。例如，可使用聚(氧乙烯)脱水山梨糖醇(吐温)，聚(氧乙烯)醚(Tritons)等物质。还可见Neugebauer,生物学和生物化学中洗涤剂的性质和用途的指南(1992)CalbiochemCorp.。本发明的过程所用表面活性剂的唯一限制是在不会引起ProGP的大量不可合物中的表面活性剂的量约为0.01-0.5%;优选0.05-0.5%;最优选约0.075-0.25%。还考虑了表面活性剂的混合物。在聚合物连接过程中，表面活性剂提供临时、可逆的保护系统。表面活性剂已经显示出可有效地选择性阻碍聚合物连接，同时使基于赖氨酸或氨基末端的连接继续进行。本发明的聚(乙二醇)修饰的ProGP具有更持久的药理学作用，这很可能归因于其在体内较长的半衰期。本发明PEG-ProGP的预期用途是从前体产生大量树突细胞，从而用作免疫的佐剂。树突细胞在免疫系统中起着至关重要的作用。它们25是在激活静息T细胞方面最有效的专门的抗原-呈递细胞，而且是用于激活体内天然T细胞的主要抗原-呈递细胞，因此，可用于引发初次免疫应答。它们可有效使可溶性肿瘤特异性抗原(Ag)内化，并进行加工和呈递。树突细胞具有使天然T细胞聚集，并通过快速上调主要组织相容性复合物(匪C)和共刺激分子的表达，细胞因子的产生，和向淋巴器官的迁移而应答Ag冲击的独特能力。因为树突细胞对于使宿主对CD4-依赖性免疫应答的新抗原敏感非常重要，因此它们还可在肿瘤免疫性的产生和调节方面发挥重要的作用。树突细胞来源于粒细胞和巨噬细胞常见的骨髓CD34+前体，并且已经在人类中确立了可产生纯树突细胞集落的独立树突细胞集落形成单位(CFU-DC)的存在。此外，已经描述过CFU后CD14+中间体具有在不同细胞因子条件下，沿着树突细胞或巨噬细胞途径分化的潜能。这种双潜能前体存在于骨髓，脐带血，和外周血中。树突细胞还可基于特异的细胞表面标记，如CDla+，CD3-，CD4-，CD20-，CD40+，CD80+和CD83+而被分离，从而确定所培养树突细胞的成熟。基于树突细胞的策略提供了一种用于增强对肿瘤和感染剂的免疫应答的方法。AIDS是另外一种可使用基于树突细胞的疗法的疾病，这是因为树突细胞可在促进HIV-1复制方面发挥重要作用。免疫疗法需要从癌症患者产生树突细胞，并使它们和来源于外科手术除去的肿瘤块的肺瘤Ag体外接触，然后将这些细胞再次注射到肿瘤患者中。肿瘤细胞膜的相对粗制剂有能力作为肺瘤抗原的来源，避免分子鉴定肺瘤抗原的必要性。所述肿瘤抗原还可以是合成的肽，碳水化合物，或核酸序列。此外，细胞因子，如本发明PEG-ProGP的伴随给药可进一步促进肿瘤免疫性的诱导。可以预见到，免疫疗法可在体内进行，其中将本发明的PEG-ProGP单独或与其它造血生长因子一起给予肿瘤患者，从而增加树突细胞数，并使内源性肺瘤抗原呈递在树突细胞上。还预测到，体内免疫疗法可以与外源抗原一起使用。还预测到，免疫疗法可以包括动员树突细胞前体或成熟的树突细胞，即将本发明的PEG-ProGP单独或与其它造血生长因子一起给予患者，除去患者中的树突细胞前体或成熟的树突细胞，使树突细胞与抗原接触，并将该树突细胞返回给患者。此外，还可单独使用本发明的PEG-ProGP或与其它造血生长因子一起离体培养已经除去的树突细胞，从而在与抗原接触之前增加树突细胞数。基于树突细胞的策略还提供一种减少自身免疫疾病中的免疫应答的方法。因为在制备充足数量和相当纯形式的细胞时遇到了困难，从而大大阻碍了对树突细胞的研究。在来自体内的细胞扩增方面，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子-a(TNF-a)配合，从造血祖细胞(CD34+细胞)离体产生树突细胞，所述造血祖细胞来源于骨髓，脐带血，或外周血，而flk-2/flt-3配体和c-kit配体(干细胞因子[SCF])则可协同提高GM-CSF加TNF-a诱导的树突细胞产生(Siena，S.等，ExperimentalHematology23:1463-1471，1995)。还提供了一种使用本发明的PEG-ProGP离体扩增树突细胞前体或成熟树突细胞，从而提供足量树突细胞，进行免疫治疗的方法。此外，还观察到本发明的聚(乙二醇)修饰的ProGP可促进从嗜中性白细胞减少症恢复。本发明的聚(乙二醇)修饰的ProGP可以具有与完整的ProGP基本上相同的生物活性，并因此可用于相同的应用中。聚(乙二醇)修饰的ProGP具有增加嗜中性白细胞数的活性，并因此可用于治疗常见的造血疾病，包括由化疗或》iL疗引起的那些。它还可用于感染的治疗和骨髓移植。本发明的修饰的ProGP可用于治疗特征在于造血系统中的骨髓细胞，红细胞样细胞，淋巴细胞，或巨核细胞水平降低，或其组合的疾病。此外，它们可用于激活成熟的骨髓细胞和/或淋巴细胞。在这些疾病之中，对使用本发明多肽进行治疗比较敏感的是白细胞减少症，即一种外周血中的循环白细胞数减少的疾病。白细胞减少症可能是由于与某些病毒或放射线接触而诱导的。它常是各种形式的癌症疗法，如与化疗药物、放射线接触，以及感染或出血的副作用。用本发明这些^f奮饰的ProGP治疗白细胞减少症可避免使用目前获得的药物进行治疗所引起的不良副作用。本发明的^f奮饰的ProGP可用于治疗或预防嗜中性白细胞减少症并，例如，用于治疗如再生障碍性贫血，周期性嗜中性白细胞减少症，特发性嗜中性白细胞减少症，Chediak-Higashi综合征，系统性红斑狼疮(SLE)，白血病，骨髓发育不良综合症及骨髓纤维化的疾病。本发明的^f务饰的ProGP可用于治疗或预防血小板减少症。目前，血小板减少症的唯一治疗方法是血小板输注，这种方法花费较高，而且有感染(HIV，HBV)和异体免疫的巨大危险，IL-11(Neumega"')已经被批准用于治疗某些血小板减少症。所述修饰的ProGP可緩和或减少对血小板输注的需要。严重的血小板减少症可由遗传缺陷，如Fan函i，s贫血症，Wiscott-Aldrich，或May-Hegglin综合征导致。获得性血小板减少症可能是由自体抗体或同种异体抗体导致，如免疫血小板减少性紫癜，系统性红斑狼疮，溶血性贫血，或胎儿-母亲不相容。此外，巨脾，播散性血管内凝固，血栓形成性血小板减少性紫癜，感染，或修复心脏瓣膜可导致血小板减少症。严重的血小板减少症还可由化疗和/或放疗或癌症引起。血小板减少症还可由癌，淋巴瘤，白血病，或纤维化而侵入骨髓而引起。本发明的修饰的ProGP可用于动员造血祖细胞和干细胞进入外周血中。外周血衍生的祖细胞已经显示出可有效使自体骨髓移植的患者重构。造血生长因子，包括G-CSF和GM-CSF已经显示出可提高外周血中的循环祖细胞和干细胞数。这样一来，可使外周干细胞聚集的过程简化，并且通过降低所需的提取次数而显著降低了过程的成本。所述修饰的ProGP可用于动员干细胞，并进一步提高外周干细胞移植术的效率。生长因子的其它预计临床用途是体外激活造血祖细胞和干细胞，用于进行基因治疗。为了具有掺入到造血祖细胞或干细胞基因组中的目标基因，需要刺激细胞分化和DM复制。造血干细胞的循环频率非常低，这意味着生长因子可用于促进基因转导，并由此提高基因治疗的临床前景。很多药物都可引起骨髓抑制或造血缺陷。这种药物的例子是化疗中使用的AZT，DDI，烷化剂和抗代谢物，抗生素如氯霉素，青霉素，更昔洛韦，柔红霉素，和磺胺类药物，phenothiazone，镇静剂，如曱丙氨酯，止痛剂，如氨基比林和安乃近，抗-惊厥剂，如苯妥英或卡马西平，抗曱状腺药，如丙基硫尿嗜啶和甲巯咪唑及利尿剂。本发明的修饰ProGP可用于预防或治疗骨髓抑制或造血缺陷，而骨髓抑制或造血缺陷常常出现于用这些药物治疗的患者中。造血缺陷还可因为病毒，细菌，或寄生虫感染而产生，而且可由肾病或肾衰竭的治疗，例如透析所导致。本发明的修饰ProGP可用于治疗这种造血缺陷。造血缺陷的治疗可以包括给予患者含有修饰的ProGP的药物组合物。本发明的修饰的ProGP还可用于在将所述细胞注射到患者中之前，通过用本发明的〗奮饰的ProGP体外处理这些细胞而激活并扩增造血前体细胞。各种免疫缺陷，例如，T和/或B-淋巴细胞缺陷，或免疫疾病，例如，类风湿性关节炎也可通过用本发明的修饰ProGP治疗而受到有益的影响。免疫缺陷可能是病毒感染，例如，HTLV-I，HTLV-II，HTLV-III，与放射线严重接触，癌症治疗或其它医学疗法的结果。本发明的修饰的ProGP可单独使用，或与其它红细胞生成素联合使用，治疗其它血细胞缺陷，包括血小板减少症(血小板缺陷)，或贫血。这些新多肽的其它用途是治疗从体内和离体骨髓移植恢复的患者，以及开发利用标准方法产生的单克隆和多克隆抗体，用于诊断或治疗用途。本发明的聚(乙二醇)-修饰的ProGP可被配制成含有药学上可接受的稀释剂，制备等渗溶液的试剂，pH-调节剂等的药物，从而将它们给予患者。上述药物可皮下，肌内，静脉内，或口服给药，这取决于治疗的目的。给药剂量也是以所治疗患者的疾病种类和状况而改变，对于成人而言，通常是注射给予0.lmg-50mg，口服给予0.lmg-5g。所含有的聚合物质优选室温时是水溶性的。这种聚合物的非限制性例子包括聚(环氧烷)均聚物，如聚(乙二醇)或聚(丙二醇)，聚(氧乙烯化多元醇)，其共聚物及其嵌段共聚物，只要能够维持嵌段共聚物的水溶性。作为基于PEG的聚合物的替换物，也可使用有效的非抗原性物质如葡聚糖，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(丙烯酰胺)，聚(乙烯醇)，基于碳水化合物的聚合物等。事实上，这些聚合物质的ot-和co-末端基团的活化可按与转化聚(环氧烷)所用相似的方式进行，这对于本领域那些普通技术人员而言是显而易见的。本领域那些普通技术人员应认识到，上述列表仅为举例说明，并考虑了具有这里所述性质的所有聚合物。在本发明中，"有效的非-抗原性，，是指本领域已知的所有物质，它是无毒的，而且不会引起哺乳动物明显的免疫原性应答。定义下列是可在这里可互换使用的缩写词及其相应含义的列表g克mg毫克ml或mL亳升RT室温PEG聚(乙二醇)本说明书中引证的所有公开出版物，专利和专利申请的全部内容都引入此处作为参考，就如同每篇独立的出版物，专利，或专利申请特定且单独引入此处作为参考。虽然已经通过举例说明和实施例描述了前述发明，以便更清楚地理解它，但在不背离本发明精神和范围的前提下，根据本发明的教导，对发明进行变化和改进对于本领域的技术人员而言是显而易见的。提供下列实施例仅仅是为了举例说明，而不是对本发明范围的限制，其已经在上面宽泛的术语中描述。在下列实施例中，ProGP多肽是ProGP-4的多肽，其氨基酸序列在图12中给出。应当理解，ProGP家族多肽的其它成员也可按照与下列实施例中举例说明的类似方式聚乙二醇化。实施例实施例1直链、30,000MW的PEG-ProGP""^^^^^^-^/^^^QCH2CH2dHPEG-醛5,20和30,000MW该实施例证实了一种通过还原烷基化生产N-末端单聚乙二醇化ProGP的基本均匀制剂的方法。大约30,000MW的甲氧基-线性PEG-丙醛试剂(ShearwaterPolymersInc.)是通过还原氨基化与ProGP的N-末端选择性偶联的，其中利用了赖氨酸残基的N-末端伯胺相对pKa值与s-氨基位置的伯胺pKa值的差异。将ProGP蛋白以l-5mg/mL30的浓度溶解在pH5.0的10mM琥珀酸钠中，或pH5.0的10mM琥珀酸钠(J.T.Baker，Phi11ipsburg)，8%乙腈(Burdick和Jackson,Muskegon,MI)中，通过加入固体M-PEG-ALD与曱氧基-PEG-丙醛，M-PEG-ALD(ShearwaterPolymersInc.,Huntsville，AL)反应，产生相对摩尔比为2-12:1的PEG:ProGP(二聚物)。反应是通过加入溶解在H20中的lMNaC腦"SigmaChemical,St.Louis,MO)至10mM的终浓度而催化的。反应于4。C时，在暗处进行18-24小时。加入1MTris碱(SigmaChemical,St.Louis,MO)到50mM的终Tris浓度和8.5的终pH值而终止反应。实施例2直链、20,000MW的PEG-ProGP甲氧基-线性、20，000MW的PEG-丙醛试剂(ShearwaterPolymersInc.)是按照实施例1描述的过程与ProGP的N-末端偶联的。实施例3直链、5,000MW的PEG-ProGP曱氧基-线性、5，000MW的PEG-丙醛试剂(Fluka)是按照实施例1描述的过程与ProGP的N-末端偶联的。实施例4支链、40,000MW的PEG—ProGP<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>曱氧基-支链、40,000MW的PEG-丙醛(PEG2-ALD)试剂(ShearwaterPolymersInc.)是按照实施例1描述的过程与ProGP的N-末端偶联的。实施例5直链、20,000MW的PEG-ProGP<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>SPA-PEG5和20,000MW该实施例证实了一种使用N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)活性酯生产单聚乙二醇化祖细胞生成素(ProGP)的基本均匀制剂的方法。将ProGP蛋白原液以l-5mg/mL的浓度溶解在pH5.0的10mM琥珀酸钠中，通过加入0.25MHEPES緩冲液而将pH滴定到7.2。然后通过加入固体SPA-PEG使该溶液与甲氧基-PEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA-PEG)反应，产生相对摩尔比为6.5:1的PEG:祖细胞生成素。反应于4"C进行1小时。通过使用0.IN醋酸降低pH值到4.0或通过加入5倍摩尔过量的TrisHC1而终止反应。MPEG-双西旨<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>II实施例6直链、3,400MW的生物素-PEG-ProGP3,400MW的生物素-PEG-CO广NHS试剂(ShearwaterPolymerslnc.)是按照实施例5描述的过程与ProGP偶联的。实施例7分支的、10，000MW的PEG-ProGPPEG2-NHS10,20和40,000MW10,000MW、分支的PEG2-NHS(ShearwaterPolymersInc.)是按照实施例5描述的过程与ProGP偶联的。实施例8分支的、20,000MW的PEG-ProGP20,000MW、分支的PEG2—SPA(ShearwaterPolymersInc.)是按照实施例5描述的过程与ProGP偶联的。实施例9分支的、40,000MW的PEG-ProGP40，000MW、分支的PEG2-SPA(ShearwaterPolymersInc.)是按照实施例5描述的过程与ProGP偶联的。实施例10直链、20,000MW的PEG—ProGP<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>BTC-PEG20，000MW20,000MW的PEG-BTC(ShearwaterPolymersInc.)是按照实施例4描述的过程与ProGP偶联的。该实施例证实了一种使用PEG的苯并三唑碳酸酯衍生物生产聚乙二醇化祖细胞生成素(ProGP)的基本均匀制剂的方法。实施例11直链、5,000MW的PEG—ProGP<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>5,000MW的琥珀酰亚胺基琥珀酸酯-PEG(SS-PEG)(ShearwaterPolymersInc.)是按照实施例5描述的过程与ProGP偶联的。该实施例证实了一种使用可水解键生产聚乙二醇化祖细胞生成素(ProGP)的基本均匀制剂的方法。实施例12直链、20，000MW的PEG-ProGPPEG-酰肼20，000MW该实施例证实了一种使用20，000MW甲氧基-PEG-酰肼，HZ-PEG(ShearwaterPolymersInc.)生产聚乙二醇化祖细胞生成素(ProGP)的基本均匀制剂的方法。将ProGP蛋白原液以l-5mg/mL的浓度溶解在pH5.0的10mM琥珀酸钠中。然后通过加入固体4吏该溶液与HZ-PEG反应，产生相对摩尔比为6.5-26:1的PEG:祖细胞生成素。反应是用终浓度2mM的碳二亚胺(EDC，EOAC)催化的。反应于4"C进行2小时。通过用0.IN醋酸降低pH值到4而终止反应。实施例13多-聚乙二醇化的种类连接两个或多个PEG的修饰ProGP(多-聚乙二醇化)也是按照实施例1-4获得的，并利用阴离子交换色谱将其从单-聚乙二醇化的种类中分离出来。连接两个或多个PEG的修饰的ProGP(多-聚乙二醇化)也可用阳离子交换色谱从单-PEG化的种类中分离出来。连接两个或多个PEG的修饰的ProGP(多-聚乙二醇化)也可按照实施例5-13获得，并按照与实施例l-4相似的方式纯化。实施例14聚乙二醇化ProGP的纯化聚乙二醇化ProGP的种类是使用单一的离子交换色谱步骤从反应混合物纯化至〉95%(SEC分析)的。离子交换色谱单-聚乙二醇化的30K20K和5K的PEG酪ProGP种类是利用单一的离子交换色谱步骤从反应混合物纯化至>95%(SEC分析)的。单-聚乙二醇化的ProGP是利用阴离子交换色谱从未修饰的ProGP和多-聚乙二醇化的ProGP纯化的(图1)。上述典型的30K醛ProGP反应混合物(50-350mg蛋白)是在Q-Sepharose高性能柱(XK26/20，70ml床体积，AmershamPharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)上纯化的，该柱在50mMTris,pH8.5(緩冲液A)中平衡。将所述反应混合物用50mMTris，8%乙腈，pH8.5稀释5倍，并以10mL/分钟的流速上样到柱上。用5倍柱体积的緩冲液A洗涤该柱子，接着用5倍柱体积的含30mMNaCl的緩冲液A洗涤。随后，用20倍柱体积的緩冲液A和30-130mM的线性NaCl梯度从柱上将各种ProGP种类洗脱下来。通过280nm()处的吸光度监测洗脱液，并收集到12mL级分。将各级分合并至聚乙二醇化的程度，例如，单，二，三等(如在实施例15中评估的)。使用1MHC1降低合并物的pH值到7.5，然后将合并物在10KOmegacell搅拌式细胞浓缩器(FiltronTechnologyCorporation,Northborough，MA)中浓缩至1-5mg/mL。合并物的蛋白浓度是使用0.97%的消光系数通过Am测定的。该过程的纯单30KPEG-醛ProGP的总产率为25-30%。阳离子交换色谱P曰离子交换色镨是在SPSepharose高性能柱(PharmaciaXK26/20,70ml床体积)上进行的，该柱在10mM醋酸钠，pH4.5(緩冲液C)中平衡。将反应混合物用緩冲液C稀释10倍，然后以5mL/分钟的流速上样到柱子上。接下来，用5倍柱体积的緩冲液洗涤该柱子，然后用5倍柱体积的12。/。緩冲液D(10mM醋酸盐，pH4.5，1MNaCl)洗涤该柱子。随后，用20倍柱体积、线性梯度的12-27。/。緩沖液D将PEG-ProGP种类从柱上洗脱下来。洗脱液是在280nm处监测的，收集到10mL级分。根据聚乙二醇化的程度(单，二，三等)合并各级分，交换到pH4.5、lOmM的醋酸盐緩冲液中，然后在装有AmiconYM10薄膜的搅拌式细胞浓缩器中浓缩至l-5mg/mL。蛋白浓度是用0.71的消光系数通过A280nm测定的。该过程单聚乙二醇化ProGP的总产率为10-50、实施例15生化表征纯的聚乙二醇化ProGP合并物是利用SDS-PAGE(图3)，非变性和变性大小排阻色谱(图2，4)，RPHPLC(图5)，胰蛋白酶绘图(图7)，和MALDI-TOF6)描述的。大小排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)非-变性SEC-HPLC30K甲氧基-PEG丙醛与ProGP的反应，阴离子交换纯化，和最终的纯化产物是使用非-变性SEC-HPLC(图2a，2b)评估的。分析型非-变性SEC-HPLC是使用Superdex200HR10/30柱(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway,NJ)，在流速为0.4mL/分钟的50mMTrispH7.5，150mMNaCl中进4亍的。PEG化可大大增加导致早期存留时间改变的蛋白流体力学体积。在30KPEG醛ProGP反应混合物连同未修饰的ProGP中，观察到两个PEG化种类。这些PEG化和非-PEG化的种类是在Q-Sepharose色谱柱上分离的(图l)，所得的纯化的单30KPEG醛ProGP随后在非-变性SEC上被洗脱为单峰(>95%纯度，图2c)。Q-Sepharose色谙步骤可有效除去单-聚乙二醇化ProGP中的游离PEG,非-PEG化的ProGP二聚物和多PEG化的种类。变性SDSSEC-HPLC用非共价pr0GP二聚物解离的变性SDSSEC证实单30KPEG醛ProGP仅在ProGP二聚物的一个亚单位(单体)上PEG化(图4)。变性SEC-HPLC是按照与非-变性SEC-HPLC所述相同的方式进4亍的，区别在于流动緩冲液中含有0.1%SDS。蛋白洗脱后，监测220nm处的吸光度。在非-变性SEC中洗脱为单峰的纯化的单30KPEG醛ProGP在变性条件下，被分离成PEG化的亚单位和非-PEG化的亚单位(如下面鉴定的)。SDSPAGE解离非-共价ProGP二聚物的SDS-PAGE可用于证实纯度，以及单30KPEG醛ProGP仅在ProGP二聚物的一个亚单位(单体)上PEG化37(图3)。SDS-PAGE是在还原和非还原条件下，在lmm厚的12%Tris甘氨酸凝胶(Invitrogen，Carlsbad,CA)上进行的，并用NovexColloidalCoomassieTMG-250染色试剂盒凝胶(Invitrogen,Carlsbad，CA)染色。在非-变性SEC中洗脱为单峰的纯化的单-30KPEG醛ProGP被分离成PEG化的亚单位和非-PEG化的亚单位。反相肌C(RPHPLC)RPHPLC是在50。C的Phe麵e親JupiterCu柱(4.6X250mm,5nm粒度)上进行的，样品以lmL/分钟上样到在40%乙腈，0.1°/。TFA中平衡的柱子上。用3mL58%乙腈洗涤该柱子。随后，用58-63%的乙腈梯度洗脱该蛋白27分钟。制备型和分析型RP-HPLC是5(TC时，在JupiterCis柱，4.6X250mm，5mm粒径，(Phenomenex，Torrance，CA)上进^f亍的。以lmL/分钟的速率将样品上样到在40%乙腈，0.1%TFA中平衡的柱子上。用3mL58%乙腈洗涤该柱子。随后，用58-63%的乙腈梯度洗脱该蛋白27分钟。监测洗脱液在214nm处的吸光度。在非-变性SEC中洗脱为单峰的纯化的PEG-ProGP在变性条件下被分离(图5)成PEG化的亚单位和未PEG化的亚单位(如下面鉴定的)。为了证实各种类的同一性，收集RP-HPLC的洗脱峰(图5)，进行MALDI-TOFMS和N-末端测序实验。N-末端序列和肽的绘图用自动埃德曼降解化学过程测定NH2-末端蛋白序列(SOP400.324)。应用生物系统模型494Procise测序4义(PerkinElmer，Wellesley,MA)用于降解。各PTH-AA衍生物是通过在线形式的RP-HPLC分析鉴定的，其中使用了装有PerkinElmer/Brownlee2.1mmi.d.PTH-C18柱的应用生物系统模型140CPTH分才;H义。与PEG-ProGP的正确质量相对应的RP-HPLC峰(图5)的N-末端测序产生了两个信号。除了缺少N-末端氨基酸外，主信号(大约75%的产率)具有PEG-ProGP的预期序列。这一结果是N-末端PEG化蛋白预期的。由于连接的PEG部分，第一次循环的残基是不可恢复的。微弱的信号(大约25%的产率)具有正确的N-末端氨基酸序列。由于从RP-HPLC收集的峰是100。/。PEG化的，因此这些数据表明，75%的PEG修饰是在具有剩余部分的N-末端进行的，所述残余部分明显与若干可能的赖氨酸残基中的一个连接。38胰蛋白酶消化PEG化的ProGP是用浓度为lmg/mL、50:1的胰蛋白酶(Promega)Dulbecco's修饰PBS(Pierce):10mMTris，pH7.5(Sigma)消化的，然后在40°MCN(B&J)，0.1%TFA(Pierce)中重构。37。C过夜消化后，加入胰蛋白酶的第二份等分试样，并于37。C再次过夜消化该溶液。消化是用5°/。1.ONHC1(Fisher)终止的，且，当需要时，将消化物4。C贮存直到使用。以0.5mL/分钟的速率将175pg注射到在35°MCN，0.1%TFA中平衡的TosoHaas3000PW柱上，洗脱50分钟(图7)。人工收集第0-25分钟的级分。利用埃德曼化学对含有PEG化片段的级分进行测序。结果表明，大约77%的PEG连接都发生在N-末端丙氨酸的ct-氨基上，其余23°/。的分布为K284为14°/。，K201为5%，K252为4%。飞行质谱的基质辅助的激光解吸离子化时间(MALDI-TOFMS)将RP-HPLC纯化的、ProGP化的PEG，非PEG化的单体浓缩，把大约1jliL的浓缩物点在用3，5-二甲氧基-4-羟基-肉桂酸作为基质的MALDI耙上。光镨是通过使用PerseptiveBiosystemsVoyagerMALDI-TOF(PerseptiveBiosystems)，以线性模式监测正离子而获得的。汇集123次扫描并求平均值。质量是使用BSA作为标准计算的。MALDI-TOFMS证实了单-30KPEG化-ProGP-4(PEG-ProGP)单体(图6)和非PEG化ProGP-4单体(数据没有给出)各亚单位的正确质量。较早的洗脱峰具有71,000kDa的分子量，与32，000kDa的PEG加39，000kDa的ProGP-4相对应。较晚的洗脱峰校正了ProGP-4的分子量(39，000kDa)。实施例16BAF3/G-CSFR细胞增殖测定用编码人G-CSF受体的基因转染的小鼠BaF3细胞系(mBaF3/hG-CSFR)可用于检测hG-CSF激动剂的活性。将mBaF3/hG-CSFR细胞以2.5X104个细胞/孔接种在含有连续稀释的ProGP和PEG化ProGP的96孔微量滴定平板中。在T"小时，用[曱基-3H]-胸腺嘧啶核苷以0.5mCi/孔对细胞进行18小时脉冲。在玻璃纤维滤垫上采集平板，并通过闪烁光谱测量掺入的放射性。该细胞系的测定培养基由以下成分组成补充了胎牛血清白蛋白(BSA)(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN)的IMDM，500pg/ml人转铁蛋白(Sigma，St.Louis,MO)，100pg/ml由2.5mg磷月旨酰胆碱/mlBSA和50mM2-巯基乙醇组成的脂类替代物。与ProGP-4相比，PEG-ProGP的G-CSF受体激动剂活性提高了(表1)。PEG-ProGP的EC"值(.005nM)比ProGP-4的测定值(021nM)大约低4倍(p<0.05)。实施例17BAF3/Flt3细胞增殖测定嵌合Flt3/G-CSF受体分子是用人Flt3的胞外和跨膜结构域，一种人IL-3前导序列，和人G-CSF受体的胞质结构域构建的。所得构建体可用于转染小鼠淋巴细胞系Baf/3。所述方案产生Baf/3的稳定克隆，该克隆在应答人FL时增殖，但在应答所试验的其它人细胞因子时不增殖。这种无性繁殖系可用于分析ProGP和聚乙二醇化ProGP的Flt3激动剂活性。将细胞以2.5X104个/孔接种在96孔微量滴定平板中，该平板含有在没有血清的IMDM中连续稀释的每种生长因子，人转铁蛋白(100jug/ml)，由2.5mg磷脂酰胆碱/ml胎牛血清白蛋白(500yg/ml)和2-巯基乙醇(50jiM)组成的脂类替代物。56小时后，用[甲基」H]-胸腺嘧啶核苷以0.5juCi/孔对细胞进行14-18小时的脉冲，采集并通过闪烁光谱测量掺入的放射性。ProGP的PEG化形式可维持ProGP-4的生物活性(表1)。40表1.ProGP-4和30KPEGALDProGP-4(实施例1)诱导的细胞增殖的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>实施例18CFU-GM集落发生测定造血祖细胞的扩增是使用来源于人骨髓的CD34+细胞，在集落形成单位粒细胞/巨噬细胞(CFU-GM)测定中证实的，其中集落发生祖细胞在半-固体培养基中应答于生长因子而分裂并分化。新鲜骨髓(BM)抽出物是与St.LouisUniversityMedicalSchool合作获得的。在用Ficoll-Hypaque进行密度梯度离心之后，回收单核细胞部分。CD34+(干和祖)细胞随后是4吏用Isolex50干细胞试剂盒(BaxterHealthcareCorporation,Deerfield，IU通过P曰性选择而分离的。该过程产生一种富集细胞产物，其中>90%的细胞都表达CD34+细胞的表面抗原。将这些CD34+细胞接种在MethoCultH4230(StemCellTechnologies,Vancouver,BC)中的35mm组织培养平板(10，000个细胞/个培养皿)中，所述MethoCultH4230含有在Iscove's修饰Dulbecco's培养基(IMDM)中的0.9%甲基纤维素，30%FBS，1%BSA,ImM2-Si基乙醇和2mML-谷酰胺。37。C时，在含有5"/。C02的湿润空气中，用生长因子温育所述培养物10-12天。在共同加入实验中，各受体激动剂的浓度在指定浓度值下是等摩尔的。造血集落(>50个细胞)是使用反相显微镜计数的。PegProGP诱导的造血祖细胞向集落形成单位粒细胞/巨噬细胞(CFU-GM)的分化和扩增与ProGP-4或人flt3配体与hG-CSF的共同给药所引起的应答相等(图8)。实施例19生长因子给药的药代动力学(PK)雌性C57BIV6(8-12周龄，CharlesRiver，Raleigh，NC)小鼠是在Pharmacia动物实验室中饲养的。ProGP和聚乙二醇化ProGP是在PBS(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)中稀释的，并以100jug/次注射的给药剂量给予小鼠。小鼠是以单一皮下(SC)剂量注射的。ProGP的ELISA小鼠血浆中的ProGP和聚乙二醇化ProGP蛋白的浓度水平是使用夹层ELISA测定的。用在lOOmMNaHC03，pH8.2中稀释到1pg/ml的、亲和纯化的山羊-抗-Flt3配体多克隆抗体，以150ml/孔包被96-孔微量滴定平板。在潮湿的腔室内，室温过夜温育该平板1小时，37。C时，用含有3BSA和0.05%聚氧乙烯-脱水山梨糖醇单月桂酸酯(吐温20)，pH7.4的磷酸盐緩冲生理盐水封闭该平板1小时。用含0.05%吐温20的150mMNaCl(洗涤緩冲液)洗涤平板4次。血浆PK样品是在pH7.4的测定緩冲液(PBS,0.1%BSA，0.01%吐温20)中稀释的，并在小鼠合并血浆的测定基质中滴定为1:2。基质和样品的血浆浓度在百分比上相匹配。将平板在37。C的湿润腔室中温育2.5小时，然后用洗涤緩冲液洗4次。将与辣根过氧化物酶连接的亲和纯化的山羊-抗人G-CSF受体激动剂多克隆抗体在测定緩冲液中稀释为1:10000(0.25-.05ng/mL)，然后向每个孔中加入150nl。将平板在37。C的湿润腔室中温育1.5小时。将孔倒空，用洗涤緩冲液再次洗涤每个孔4次。然后，向各孔中加入150mL的TMB过氧化物酶底物溶液。将平板在室温温育约10分钟，在孩i量滴定平板读数器(MolecularDevicesCorporation)上在650nm的试验波长下读数。未知PK样品中，免疫-反应性ProGP的浓度是根据ProGP-4或PEG-ProGP的标准曲线计算的，其中4吏用了由MolecularDevices提供的4个参数的曲线拟合程序。药代动力学数据分析表2中报告的PK参数是使用WinNonlin(3.G版本，Pharsight，ChapelHill,NC)通过非分段分析测定的。求血浆浓度数据(n=3)的平均值，单一的PK分析是在平均值基础上进行的。表现终末半衰期(twO是在非分段分析过程中，通过血浆浓度对时间的对数线性图人工目测选择的。ProGP-4和PEG-ProGP的药代动力学比较在图9和表2中给出。该数据显示，与ProGP-4相比，皮下给予小鼠的单一的100jug剂量PEG-ProG具有延长了的血浆存留时间。第48小时的时候，血浆中PEG-ProGP的浓度大约比ProGP-4高70倍。可检测水平的PEG-ProGP是在给药96小时后观察到的，而ProGP-4在第72小时的时候仍然检测不到。PEG-ProGP和ProGP-4的PK值，如终末半衰期(t1/2)，清除率(C1)，达到最大浓度的时间(Tmax)和最大浓度(Cmax)没有显著性差异。总之，PEG化可延长蛋白在小鼠血液中循环的时间。表2.ProGP-4和PEGProGP-4(实施例1)在小鼠中的药动学比较小鼠(n)给药剂量(Hg/小鼠)T*maxG*nmxAUCa)CL/FVd/Ftl/2(%8小时ProGP3100828,0005290.1890.9443.4672PEGProGP-43100(8)24a19，5007200.1390.9774.874744PEGProGP-43100840,50010800.09260.6574.924181生长因子给药的药效学(PD)雌性C57BL/6(8-12周龄，CharlesRiver,Raleigh,NC)小鼠是在Pharmacia动物实验室中祠养的。ProGP-4和PEG-ProGP是在PBS"ifeTechnologies,GrandIsland,NY)中稀释的，并以100-500Hg/次注射的剂量给予小鼠。小鼠是如下皮下(SC)注射的在第0-6天或第0-9天，每天给予ProGP-4(0.lmg/次注射)；在第0，3和6天或第0,3，6和9天给予PEG-ProGP(0.3mg/次注射)；在第0天或第0和5天给予PEG-ProGP(0.5mg/次注射)。在第0-9天每天给予PBS赋形剂对照(0.lml/次注射)。43外周血和脾脏的处理外周血是通过心脏穿刺从co广麻醉小鼠中采集到肝素包被的试管中的。脾脏是在釆集血液之后，立即从无痛处死动物中采集的。总白细胞(WBC)数是使用细胞计数器(CoulterZM，MiamiLakes,FL)对全血进行的。红细胞是使用0.15M低渗氯化铵溶液(StemCellTechnology,Vancouver,BC)溶解的。离心(300xg，10分钟)收集细胞，并用含2%FBS(IMDM-FBS，BioproductsforScience,Indianapolis,IN)的冷IMDM(LifeTechnologies，GrandIsland,NY)洗涤。采集脾脏，并在冷的IMDM-FBS中处理，均化成细胞混悬液，并通过70jum的尼龙薄膜过滤。红细胞是使用低渗氯化铵溶液溶解的，脾细胞是使用冷的IMDM-FBS洗涤的，并通过70jum的筛网过滤。将脾细胞重悬浮在25ml含2%BSA的IMDM緩冲液中，计数以确定脾细胞/脾脏的总数。流式细胞术的试剂荧光染料-或生物素-连接的单克隆抗体是从Pharmingen(SanDiego，CA)购买的。CD16/CD32(FcII/I11受体，FcBlock)，FITC-连接的抗体CDllc/HL3和PE-连接的抗体II类MHC(I-Ab//AF6-120.l)是以1-5jug/ml使用的。不同的抗体组合使用同型匹配的对照组。每三天给药的ProGP-4与每天给药的PEG-ProGP相比，脾脏中的总白细胞(WBC)和树突细胞(DC)应答是类似的(图10)。第IO天时，在外周血中的相对DC应答方面，每三天给药的PEG-ProGP比每天给药的ProGP-4要强。ProGP-4和PEG-ProGP-4(实施例1)在脾脏中的DC动员动力学相似(图11);而，在外周血中，与每天给药的ProGP-4相比，每三天给药的PEG-ProGP-4(实施例1)的DC动员动力学发生了改变。权利要求1.一种祖细胞生成素连接物，它具有至少一个与生物活性祖细胞生成素多肽的至少一个氨基酸残基共价连接的水溶性聚合物分子。2.根据权利要求1所述的祖细胞生成素连接物，其中所述聚合物是聚(环氧乙烷)分子。3.根据权利要求2所述的祖细胞生成素连接物，其中所述聚(环氧乙烷)分子是聚(乙二醇)分子。4.根据权利要求3所述的祖细胞生成素连接物，其中所述聚(乙二醇)连接在具有游离氨基，羧基或巯基的氨基酸残基上。5.根据权利要求4所述的祖细胞生成素连接物，其中所述聚(乙二醇)是通过活化的聚(乙二醇)连接的。6.根据权利要求5所述的祖细胞生成素连接物，其中所述活化的聚(乙二醇)选自对硝基苯基，琥珀酰亚胺基，羰基咪唑，氮杂内酯，环状亚胺硫酮，异氰酸酯，异硫氰酸酯，窿，伯胺，肼，酰肼，肼基甲酸酯，氨基甲酸酯，硫代肼基甲酸酯，硫醇，马来酰亚胺，砜，和苯甲酰曱醛。7.根据权利要求6所述的祖细胞生成素连接物，其中所述活化的聚(乙二醇)选自琥珀酰亚胺基，羰基咪唑，醛，酰肼，肼基甲酸酯，氨基甲酸酯，和马来酰亚胺。8.根据权利要求7所述的祖细胞生成素连接物，其中所述聚(乙二醇)的分子量约为0,5kDa-100kDa。9.根据权利要求8所述的祖细胞生成素连接物，其中所述聚(乙二醇)的分子量约为3.4kDa-40kDa。10.根据权利要求4所述的祖细胞生成素连接物，其中所述聚(乙二醇)是支化聚合物。11.根据权利要求10所述的祖细胞生成素连接物，其中支化聚(乙二醇)聚合物的分子量约为10kDa-40kDa。12.根据权利要求4所述的祖细胞生成素连接物，其中所述聚(乙二醇)是双官能聚合物。13.才艮据权利要求l，2，3，4,5，6，7，8，9，10，11，或12所述的祖细胞生成素连接物，其中所述祖细胞生成素多肽的通式为Ri一L「R2，R广L!-R!，R广R2，或R广R!其中R!是含有下式的经修饰的flt-3配体氨基酸序列的多肽:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中N-末端与C-末端直接连接，或通过能够连接N-末端和C-末端并分别在下列氨基酸位置具有新的C-末端和N-末端的连接体(L2)连接<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中Ib是选自集落刺激因子，细胞因子，淋巴因子，白介素和造血生长因子的因子；其中L是能够连接Ri和R2的连接体；且可任选直接在所述祖细胞生成素蛋白前面加上(甲硫氨酸—1)，(丙氨酸—J或(甲硫氨酸—2，丙氨酸—')。14.一种含有权利要求1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12所述的祖细胞生成素蛋白和至少一种药学上可接受的载体的组合物。15.—种治疗患有造血疾病的患者的方法，包括给予所述患者治疗有效量的权利要求l，2，3，4，5，6，7，8,9，10，11，或12所述的祖细胞生成素连接物。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述造血疾病是嗜中性白细胞减少症，白细胞减少症，血小板减少症，或贫血症。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述造血疾病是由化疗，放疗，或骨髓抑制药物导致的。18.—种治疗正在从骨髓移植，烧伤，创伤，寄生虫，细菌或病毒感染恢复和/或经受骨髓移植，烧伤，创伤，寄生虫，细菌或病毒感染的患者的方法，包括给予所述患者治疗有效量的权利要求1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11,或12所述的祖细胞生成素连接物。19.一种动员造血祖细胞和干细胞进入外周血中的方法，包括给予所述患者治疗有效量的权利要求1，2，3，4，5，6，7，8，9，10,11，或12所述的祖细胞生成素连接物。20.—种产生树突细胞的方法，包括下列步骤a)从其它细胞中分离造血祖细胞或CD34+细胞；并b)在含有权利要求l，2，3，4,5，6，7，8，9，10，11，或12所述的造血蛋白的生长培养基中培养所述造血祖细胞或CD34+细胞。21.根据权利要求20所述的方法，进一步包括下列步骤c)用抗原对所述培养的造血祖细胞或CD34+细胞进行脉冲。22.根据权利要求20所述的方法，其中所述生长培养基进一步含有选自GM-CSF，IL-4，TNF-a，干细胞因子(SCF)，flt-3配体，IL-3，IL-3变体，IL-3变体融合蛋白，和多功能受体激动剂的一种或多种因子。23.根据权利要求21所述的方法，其中所述生长培养基进一步含有选自GM-CSF，IL-4，TNF-cc，干细胞因子(SCF)，fit-3配体，IL-3，IL-3变体，IL-3变体融合蛋白，和多功能受体激动剂的一种或多种因子。24.—种治疗患有肿瘤，感染或自身免疫疾病的人的方法，包括给予该人权利要求l，2,3，4，5，6，7，8，9，10，11,或12所述的造血蛋白的步骤。25.根据权利要求24所述的方法，进一步包括给予选自GM-CSF，IL-4，TNF-ct，干细胞因子(SCF)，fit-3配体，IL-3，IL-3变体，IL-3变体融合蛋白，和多功能受体激动剂的一种或多种因子。26.—种使聚(乙二醇)与亲核物质连接的方法，其中所述连接是在无机溶剂存在的条件下进行的。全文摘要本发明提供一种通过使水溶性聚合物与蛋白结合而制备的化学修饰的祖细胞生成素(ProGP)。本发明的化学修饰蛋白具有比未修饰ProGP更持久的增加嗜中性白细胞的活性，能够减少剂量并确定时机。文档编号A61P7/08GK101426511SQ02816517公开日2009年5月6日申请日期2002年6月14日优先权日2001年6月22日发明者N·R·西格尔,R·F·芬恩,R·L·希尔斯申请人:法马西亚公司