高产香兰素的重组型拟无枝酸菌、其构建方法及应用与流程

本发明属于基因工程。特别涉及一种高产香兰素的重组型拟无枝酸菌，还涉及所述菌株的构建方法及应用。

背景技术：

1、香兰素(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)是食品和香水生产工业中最重要的芳香族风味化合物之一。与许多其他低分子量酚类化合物一样，香兰素具有抗氧化和抗菌特性，因此具有作为食品防腐剂的潜力。它对革兰氏阳性和革兰氏阴性的食物腐败细菌都有活性，并已被证明对水果纯菌和实验室生长培养基中的酵母和霉菌都有效。香兰素被认为是世界上最重要的口味之一。它被广泛应用于食品、饮料、香水和制药行业。

2、目前，市场上香兰素的生产方式主要包括植物提取、化学合成、微生物转化。由于天然提取法与化学合成法存在种种不足，致使人们越来越重视微生物转化法生产香兰素，其中，丁香酚、异丁香酚和阿魏酸是该法生产香兰素的主要底物。丁香酚作为一种廉价的原料被广泛用于药品、食品、香料、抗氧化剂等，有望成为生态友好型化学合成物质的主要成分。tadasa首次报道了棒状杆菌能够将丁香酚转化为香兰素，该菌能以丁香酚为唯一的碳源和能源得到阿魏酸与香兰素。ashengroph等分离出一株食树脂假单胞菌(pseudomonasresinovoransspr1)，该菌株能够将丁香酚转化为香兰素及相关酚醛芳香产物。在进一步优化条件之前，经过30h和60h的生物转化后分别产生0.24g/l香兰素(转化率为10％)和1.1g/l香草酸(转化率为44％)。研究人员还建立了从丁香酚到香兰素的两步生物转化过程，第一步，先用重组大肠杆菌xl1-blue(pskvaompcalamcalb)将丁香酚转化为阿魏酸，阿魏酸最大浓度可达14.7g/l；第二步，再用大肠杆菌(pskeche/hfcs)将阿魏酸转化为香兰素，香兰素产率为0.3g/l。

3、上述研究方法香兰素产量较低，本发明根据目前已清晰的香兰素合成途径，以可代谢有毒物质和低香兰素降解率的拟无枝酸菌为研究平台，对合成香兰素的关键蛋白进行不同来源基因挖掘，以期能通过基因改造提供一种高产香兰素的拟无枝酸菌。

技术实现思路

1、本发明的目的是通过基因改造提供一种以丁香酚为底物高产香兰素的重组型拟无枝酸菌工程菌株，还提供所述工程菌株的构建方法及应用。

2、为了实现上述目的，本发明提供一种以丁香酚为底物高产香兰素的重组型拟无枝酸菌工程菌株，所述重组拟无枝酸菌含有重组质粒，所述重组质粒含有能够积累香兰素合成的前体物质阿魏酸(ferulic acid)的关键基因，所述关键基因编码的蛋白质为香草醇氧化酶、松柏醇脱氢酶松柏醛脱氢酶。

3、在本发明中，优选地，所述香草醇氧化酶来自杜鹃花、树链格孢菌、轮枝镰刀菌、木桫椤或可可豆；所述松柏醇脱氢酶来诺卡氏菌、紫花苜蓿、杜根氏菌、石竹或中生根瘤菌；所述经松柏醛脱氢酶来自拟南芥、嗜环弧菌、水稻、巴西杆菌或海藻。

4、作为一种特别优选的实施方式，所述香草醇氧化酶来自轮枝镰刀菌，其核苷酸序列如seq id no.1所示；所述松柏醇脱氢酶来自紫花苜蓿，其核苷酸序列如seq id no.2所示；所述松柏醛脱氢酶来自海藻，其核苷酸序列如seq id no.3所示。

5、基于此，本发明还提供上述重组拟无枝酸菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：

6、(1)构建含有香草醇氧化酶基因的重组工程菌株

7、获取并合成来源于杜鹃花(drvaoa)、树链格孢菌(aavaoa)、轮枝镰刀菌(fvvaoa)、木桫椤(xcvaoa)和可可豆(ltvaoa)的香草醇氧化酶(vaoa)基因序列；分别以bamhi/nsii为酶切位点双酶切载体pkc1139并连接获得重组质粒pkc1139-drvaoa、pkc1139-aavaoa、pkc1139-fvvaoa、pkc1139-xcvaoa和pkc1139-ltvaoa，将以上质粒通过接合转移的方法转化到拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)中，经阿伯拉霉素抗性筛选出的重组工程菌株，经pcr方式验证正确；

8、(2)构建含有香草醇氧化酶和松柏醇脱氢酶基因的重组工程菌株

9、获取并合成来源于诺卡氏菌(ngcala)、紫花苜蓿(mscala)、杜根氏菌(dvcala)、石竹(tccala)和中生根瘤菌(mlcala)的松柏醇脱氢酶(cala)基因序列；分别以xbai/spei为酶切位点双酶切载体pkc1139-fvvaoa并连接获得重组质粒pkc1139-fvvaoangcala、pkc1139-fvvaoamscala、pkc1139-fvvaoadvcala、pkc1139-fvvaoatccala和pkc1139-fvvaoamlcala，将以上质粒通过接合转移的方法转化到拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)中，经阿伯拉霉素抗性筛选出的重组工程菌株，经pcr方式验证正确；

10、(3)构建含有香草醇氧化酶、松柏醇脱氢酶和松柏醛脱氢酶基因的重组工程菌株

11、获取并合成来源于拟南芥(atcalb)、嗜环弧菌(vccalb)、水稻(obcalb)、巴西杆菌(pbcalb)或海藻(mncalb)的松柏醛脱氢酶(calb)基因序列；分别以xbai/spei为酶切位点双酶切载体pkc1139-fvvaoamscala并连接获得重组质粒pkc1139-fvvaoamscalaatcalb、pkc1139-fvvaoamscalavccalb、pkc1139-fvvaoamscalaobcalb、pkc1139-fvvaoamscalapbcalb、pkc1139-fvvaoamscalamncalb，将以上质粒通过接合转移的方法转化到拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)中，经阿伯拉霉素抗性筛选出的重组工程菌株，经pcr方式验证正确。

12、本发明提供并验证了上述基因重组型拟无枝酸菌在以丁香酚为底物生产香兰素中的应用。

13、在本发明中，构建重组型拟无枝酸菌时，将重组质粒转化到拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)时的出发菌株为拟无枝酸菌(amycolatopsis sp.)hm-141，该菌株已于2021年7月9日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为cgmcc no.22871。该拟无枝酸菌hm-141也记载于中国发明专利申请cn 2021109397312。

14、拟无枝酸菌amycolatopsis sp.hm-141能够以阿魏酸为底物生产香兰素，实现的摩尔转化率高达87％，且产物中的杂质含量少，香兰醇的检出量为0，香兰酸的检出量为0.25g/l。

15、本发明验证了通过分别构建含有不同来源香兰素合成基因香草醇氧化酶、松柏醇脱氢酶和松柏醛脱氢酶的重组质粒，将所述重组质粒通过接合转移的方式转化到不同的拟无枝酸菌中，经阿伯拉霉素抗性筛选出提高香兰素产量的重组菌。本发明的重组拟无枝酸菌含有来源于轮枝镰刀菌(fvvaoa)的香草醇氧化酶(vaoa)、来源于紫花苜蓿(mscala)的松柏醇脱氢酶(cala)基因和来源于海藻(mncalb)的松柏醛脱氢酶(calb)基因，能够以丁香酚为底物发酵产香兰素，该重组菌发酵培养后得到的种子液培养物中香兰素的浓度可达到9.34g/l，转化率达到84.68％，在5l发酵罐中发酵可实现香兰素的浓度为20.2g/l，显著高于其他同类型的香兰素产量。