【】本发明涉及标记多肽及其制造方法。本发明涉及修饰多肽及其制造方法。本发明涉及含标记多肽或修饰多肽的试剂。本发明涉及目标物质的测定方法。
背景技术
0、
背景技术:
1、转谷氨酰胺酶(tg)是以多肽中的谷氨酰胺残基作为底物,催化在所述谷氨酰胺残基的羧酰胺侧链和伯胺的氨基之间形成酰胺键的反应的酶。更具体而言,在tg催化的反应中,处于多肽中的谷氨酰胺残基的羧酰胺侧链的氨基和伯胺缩合而所述伯胺所具有的取代基转移到谷氨酰胺残基,生成氨。近年知晓,利用tg,使含谷氨酰胺残基的多肽结合如药物或标记一样的功能性物质的技术。
2、例如,在专利文献1中记载了,使向重链的c末端附加含谷氨酰胺残基的肽标签的抗体和与具有氨基的接头连接的抗癌药在tg的存在下反应而得到结合有抗癌药的抗体。在利用tg的多肽向功能性物质的结合中,一般使用两端具有官能团的二官能性接头。作为二官能性接头的官能团,选择作为tg催化的反应中的胺供体的氨基(-nh2)和用于使功能性物质与接头共价键合的任意的官能团。多肽中的谷氨酰胺残基和功能性物质经这样的接头结合。
3、【现有技术文献】
4、【专利文献】
5、【专利文献1】美国专利申请第2018/0037921号说明书
6、【发明的概要】
7、【发明要解决的课题】
8、本发明人尝试了使用记载在先前文献1的接头,使多肽中的谷氨酰胺残基结合功能性物质,但不必然以充分的效率发生结合。从而,本发明旨在提供使对于多肽以高效率结合标记变得可能的手段。
9、【用于解决课题的手段】
10、本发明人发现,通过作为二官能性接头而使用具有巯基(-sh)及氨基的聚乙二醇(peg)链之中peg链部分的分子量1100以上的接头,可在多肽中的谷氨酰胺残基有效结合所述接头及标记,从而完成本发明。
11、本发明提供含具有下式(i)所示的侧链的谷氨酰胺残基的标记多肽。
12、【化1】
13、
14、(式中,(c)是谷氨酰胺残基的α碳,x是直链亚烷基,y是peg链,z是标记,l是间隔物或连接键,peg链的分子量是1100以上。)
15、本发明提供含具有下式(ii)所示的侧链的谷氨酰胺残基的修饰多肽。
16、【化2】
17、
18、(式中,(c)是谷氨酰胺残基的α碳,x是直链亚烷基,y是peg链,peg链的分子量是1100以上。)
19、本发明提供含上述的标记多肽或修饰多肽的试剂。本发明提供目标物质的测定方法,其包括形成上述的标记多肽和目标物质的免疫复合体的工序,检测由免疫复合体中所含的标记发生的信号的工序。
20、本发明提供修饰多肽的制造方法,其包括:通过在转谷氨酰胺酶的存在下,使含谷氨酰胺残基的多肽和下式(vi)所示的接头接触,在谷氨酰胺残基的羧酰胺侧链结合接头的工序,取得由羧酰胺侧链和接头的结合生成的修饰多肽的工序,在修饰多肽中上述谷氨酰胺残基的侧链由上式(ii)所示。
21、nh2-x-y-sh(vi)
22、(式中,x是直链亚烷基,y是peg链,peg链的分子量是1100以上。)
23、本发明提供标记多肽的制造方法,包括:通过在转谷氨酰胺酶的存在下,使含谷氨酰胺残基的多肽和上式(iv)所示的接头接触,向谷氨酰胺残基的羧酰胺侧链结合接头的工序,取得由羧酰胺侧链和接头的结合生成的修饰多肽的工序,通过使修饰多肽和具有马来酰亚胺基的标记接触,在与修饰多肽结合的接头结合标记的工序,取得由修饰多肽和标记的结合生成的标记多肽的工序,在标记多肽中谷氨酰胺残基的侧链由上式(i)所示。
24、【发明的效果】
25、由本发明,通过使用具有氨基及巯基的接头,使以高的效率向多肽结合标记变得可能。
26、【附图的简单的说明】
27、【图1a】是显示本实施方式的试剂的一例的图。
28、【图1b】是显示本实施方式的试剂盒的一例的图。
29、【图2a】是显示sh-peg-nh2接头(2k)(sigma-aldrich公司)的由infusion法的质谱分析(infusion ms)的结果的图。
30、【图2b】是显示不同批的sh-peg-nh2接头(2k)(sigma-aldrich公司)的infusionms的结果的图。
31、【图2c】是显示sh-peg-nh2接头(2k)(biopharma peg scientific inc公司)的infusion ms的结果的图。
32、【图2d】是显示sh-peg-nh2接头(2k)(creative pegworks公司)的infusion ms的结果的图。
33、【图3】是显示csf001-5fab-q标签和sh-peg-nh2接头(2k)(sigma-aldrich公司)的由tg的反应后的生成物的尺寸排除柱层析(sec)分析的结果的图。
34、【图4】是显示在不同的ph的csf001-5fab-q标签和sh-peg-nh2接头(2k)(sigma-aldrich公司)的由tg的反应后的生成物的sec分析的结果的图。
35、【图5】是显示csf028-22fab-q标签和sh-peg-nh2接头(2k)(sigma-aldrich公司)的由tg的反应后的生成物的sec分析的结果的图。
36、【图6】是显示csf001-5fab-q标签和sh-peg-nh2接头(3.5k)(sigma-aldrich公司)的由tg的反应后的生成物的sec分析的结果的图。
37、【图7】是显示自csf001-5fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和马来酰亚胺修饰alp的偶联反应液的由sec及非还原sds-page的分析的结果的图。
38、【图8a】是显示自csf001-5fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和马来酰亚胺修饰alp的偶联反应液的sec分析的结果的图。
39、【图8b】是显示分取的级分的由非还原sds-page的分析的结果的图。
40、【图8c】是显示分取的级分的sec分析的结果的图。
41、【图9】是显示自csf028-22fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和马来酰亚胺修饰alp的偶联反应液的sec分析的结果的图。
42、【图10a】是显示从自csf028-22fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和马来酰亚胺修饰alp的偶联反应液分取的级分的sec分析的结果的图。
43、【图10b】是显示从自csf028-22fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和马来酰亚胺修饰alp的偶联反应液分取的级分的由非还原sds-page的分析的结果的图。
44、【图11a】是显示sf001-5fab'和马来酰亚胺修饰alp的偶联反应液的sec分析的结果的图。
45、【图11b】是显示从sf001-5fab'和马来酰亚胺修饰alp的偶联反应液分取的级分的由非还原sds-page的分析的结果的图。
46、【图12】是显示从sf001-5fab'和马来酰亚胺修饰alp的偶联反应液分取的级分的sec分析的结果的图。
47、【图13a】是显示由使用fab-peg-alp及(fab')n-alp的各自的酶联免疫吸附法(elisa)测定hiv-1p24之时的信号的值的坐标图。
48、【图13b】是显示由使用fab-peg-alp及(fab')n-alp的各自的elisa测定hiv-1p24之时的噪声的值的坐标图。
49、【图13c】是显示由使用fab-peg-alp及(fab')n-alp的各自的elisa测定hiv-1p24之时的信号/噪声(s/n)比的坐标图。
50、【图14】是显示由使用fab-peg-alp及(fab')n-alp的各自的elisa测定人血清之时的背景的坐标图。
51、【图15】是显示hbs628fab-q标签和sh-peg-nh2接头(2k)(sigma-aldrich公司)的由tg的反应后的生成物的sec分析的结果的图。
52、【图16a】是显示自hbs628fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和马来酰亚胺修饰生物素的偶联反应液的sec分析的结果的图。
53、【图16b】是显示从自hbs628fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和马来酰亚胺修饰生物素的偶联反应液分取的级分的由非还原sds-page的分析的结果的图。
54、【图16c】是显示从自hbs628fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和马来酰亚胺修饰生物素的偶联反应液分取的级分的sec分析的结果的图。
55、【图17a】是显示hbs628fab-q标签的非还原样品的液相层析质谱分析(lc-ms)的结果的图。
56、【图17b】是显示hbs628fab-q标签的还原的样品的lc-ms的结果的图。
57、【图18】是显示hbs628fab-q标签和其sh-peg-fab及生物素-peg-fab的非还原样品的lc-ms的结果的图。
58、【图19】是显示hbs628fab-q标签及其sh-peg-fab的还原的样品的lc-ms的结果的图。
59、【图20】是显示自hbs628fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和马来酰亚胺修饰alp的偶联反应液的sec分析的结果的图。
60、【图21】是显示将自hbs628fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和马来酰亚胺修饰alp的偶联反应液和各原料由非还原sds-page分析的结果的图。
61、【图22】是显示csf001-25fab-q标签和sh-peg-nh2接头(2k)(sigma-aldrich公司)的由tg的反应后的生成物的sec分析的结果的图。
62、【图23a】是显示自csf001-25fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和alexa488-马来酰亚胺的偶联反应液的sec分析的结果的图。
63、【图23b】是显示确认脱盐及纯化自csf001-25fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和alexa488-马来酰亚胺的偶联反应液的级分的sec中的uv及荧光吸收的结果的图。
64、【图24a】是显示csf001-25fab-q标签和其sh-peg-fab及alexa488-peg-fab的还原的样品的lc-ms的结果的图。
65、【图24b】是图24a中所示的分析结果的放大图。
66、【图25】是显示抗cd20 fab-q标签和别批的sh-peg-nh2接头(2k)(sigma-aldrich公司)的由tg的反应后的生成物的sec分析的结果的图。
67、【图26a】是显示对r-藻红蛋白(r-pe)和emcs试剂的反应液进行sec分析的结果的图。
68、【图26b】是显示对r-pe和emcs试剂的反应液进行逆相hplc分析的结果的图。
69、【图27】是显示自csf001-25fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和马来酰亚胺修饰r-pe的偶联反应液的sec分析的结果的图。左侧小图是利用uv(280nm)的层析谱。右侧小图是对于偶联反应液的利用uv(280nm)及荧光(激发波长565nm/荧光波长574nm)的层析谱。
70、【图28】是显示从自sf001-25fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和马来酰亚胺修饰alp的偶联反应液分取的级分的sec分析的结果的图。左侧小图是利用uv(280nm)的层析谱。右侧小图是利用荧光(激发波长565nm/荧光波长574nm)的层析谱。
71、【图29】是显示自抗cd20 fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和马来酰亚胺修饰r-pe的偶联反应液的sec分析的结果的图。左侧小图是利用uv(280nm)的层析谱。右侧小图是对于偶联反应液的利用uv(280nm)及荧光(激发波长565nm/荧光波长574nm)的层析谱。
72、【图30】是显示从自抗cd20 fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和马来酰亚胺修饰alp的偶联反应液分取的级分的sec分析的结果的图。左侧小图是利用uv(280nm)的层析谱。右侧小图是利用荧光(激发波长565nm/荧光波长574nm)的层析谱。
73、【图31a】是显示将csf001-25fab-q标签和抗原的相互作用由biacore(商标)t200(cytiva公司)测定的结果的图。
74、【图31b】是显示将自csf001-25fab-q标签的sh-peg(2k)-fab和抗原的相互作用由biacore(商标)t200测定的结果的图。
75、【图31c】是显示将csf001-25fab-q标签和抗原的相互作用由biacore(商标)t200测定的结果的图。与图31a在测定日上不同。
76、【图31d】是显示将自csf001-25fab-q标签的alexa488-peg-fab和抗原的相互作用由biacore(商标)t200测定的结果的图。
77、【图32a】是显示使用自csf001-25fab-q标签的fab-peg-r-pe、(fab-peg)2-r-pe及(fab-peg)3-r-pe的各自进行由elisa的测定(抗原的添加无)的结果的图。
78、【图32b】是显示使用自csf001-25fab-q标签的fab-peg-r-pe、(fab-peg)2-r-pe及(fab-peg)3-r-pe的各自进行由elisa的测定(有抗原的添加)的结果的图。
79、【图33】是显示由使用自抗cd20 fab-q标签的fab-peg-r-pe、(fab-peg)2-r-pe及(fab-peg)3-r-pe的各自的fcm法测定表达cd20的细胞的结果的图。
80、【图34a】是显示sh-peg-nh2接头(3.5k)(sigma-aldrich公司)的infusion ms的结果的图。
81、【图34b】是显示sh-peg-nh2接头(5k)(sigma-aldrich公司)的infusion ms的结果的图。
82、【图35a】是显示csf001-25fab-q标签和sh-peg-nh2接头(3.5k)(sigma-aldrich公司)的由tg的反应后的生成物的sec分析的结果的图。
83、【图35b】是显示csf001-25fab-q标签和sh-peg-nh2接头(5k)(sigma-aldrich公司)的由tg的反应后的生成物的sec分析的结果的图。
84、【图35c】是显示csf001-25fab-q标签和sh-peg-nh2接头(3.5k)(sigma-aldrich公司)及sh-peg-nh2接头(5k)(sigma-aldrich公司)的各自的由tg的反应后的生成物的由非还原sds-page的分析的结果的图。
85、【图36a】是显示自csf001-25fab-q标签的sh-peg(3.5k)-fab和alexa488-马来酰亚胺的偶联反应液的sec分析的结果的图。
86、【图36b】是显示确认脱盐及纯化自csf001-25fab-q标签的sh-peg(3.5k)-fab和alexa488-马来酰亚胺的偶联反应液的级分的sec中的uv及荧光吸收的结果的图。
87、【图37a】是显示自csf001-25fab-q标签的sh-peg(5k)-fab和alexa488-马来酰亚胺的偶联反应液的sec分析的结果的图。
88、【图37b】是显示确认脱盐及纯化自csf001-25fab-q标签的sh-peg(5k)-fab和alexa488-马来酰亚胺的偶联反应液的级分的sec中的uv及荧光吸收的结果的图。
89、【图38】是显示csf001-5fab-q标签和sh-peg-nh2接头(400da)(nanocs inc.公司)的由tg的反应后的生成物的sec分析的结果的图。
90、【图39】是显示自csf001-5fab-q标签的sh-peg(400da)-fab和马来酰亚胺修饰alp的偶联反应液的sec分析的结果的图。
91、【图40】是显示csf001-5fab-q标签和sh-peg-nh2接头(1k)(creative pegworks公司)的由tg的反应后的生成物的sec分析的结果的图。
92、【图41】是显示自csf001-5fab-q标签的sh-peg(1k)-fab和马来酰亚胺修饰alp的偶联反应液的sec分析的结果的图。
技术实现思路