稳定表达TGF-βII型受体的工程化巨噬细胞及其在肺纤维化治疗中的应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种稳定表达tgf-βii型受体的工程化巨噬细胞及其在肺纤维化治疗中的应用。

背景技术：

1、肺纤维化是一种由多种病因引起的，以巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞在肺泡的堆积，以及纤维结缔组织的发展为主要特点，并最终导致患者正常肺组织结构改变的一种慢性进行性肺间质疾病。肺纤维化严重影响人体呼吸功能，表现为干咳、进行性呼吸困难(自觉气不够用)，且随着病情和肺部损伤的加重，患者呼吸功能不断恶化。

2、肺纤维化的发生需要多种细胞因子的参与，而转化生长因子β(tgf-β)在致纤维化细胞因子网络中占主导地位，tgf-β介导肺纤维化发生主要是通过与tgf-βii型受体胞外区(ex-tβrii)识别结合，进一步募集i型受体发生磷酸化，并启动下游一系列信号转导。通过使用tgf-βii型受体(tβr2)或抗tgf-β1抗体，阻断tgf-β1与ex-tβrii的结合，成为改善肺纤维化的一种选择。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种稳定表达tgf-βii型受体(简称tβr2)的工程化巨噬细胞及其在肺纤维化治疗中的应用。

2、第一方面，本发明要求保护一种制备表达tβr2-fc蛋白的巨噬细胞的方法。

3、本发明所要求保护的制备表达tβr2-fc蛋白的巨噬细胞的方法，可包括如下步骤：使巨噬细胞表达tβr2-fc蛋白，得到表达tβr2-fc蛋白的巨噬细胞。

4、在所述方法中，使巨噬细胞表达tβr2-fc蛋白是通过向巨噬细胞中导入含有编码tβr2-fc蛋白的基因的重组载体实现的。

5、其中，所述tβr2-fc蛋白为将tgf-βii型受体和抗体fc段融合而成的融合蛋白。

6、进一步地，所述tgf-βii型受体的氨基酸序列如seq id no.2的第32-194位所示。

7、进一步地，所述抗体fc段的氨基酸序列如seq id no.2的第195-419位所示。

8、更进一步地，所述tβr2-fc蛋白可为如下任一：

9、(a1)氨基酸序列如seq id no.2或seq id no.2的第32-419位所示的蛋白质；

10、(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

11、(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

12、(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

13、上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

14、上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

15、上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

16、在上述方法中，所述重组载体可为重组慢病毒载体。

17、相应地，所述方法可包括如下步骤：

18、(b1)利用所述重组慢病毒载体和慢病毒包装质粒转染慢病毒包装细胞，培养，获得重组慢病毒；

19、(b2)将步骤(b1)得到的重组慢病毒感染巨噬细胞，从而获得表达tβr2-fc蛋白的巨噬细胞。

20、在本发明的具体实施方式中，所述重组慢病毒载体为将tβr2-fc蛋白的编码基因插入到pcdh-mcherryp载体的多克隆位点(xbai和bamhi)之间后得到的重组质粒。所述pcdh-mcherryp载体为将pcdh-mscv-mcs-ef1α-gfp-t2a-puro载体(sbi公司产品，cat.#cd713b-1)中的gpf编码基因替换为mcherryp编码基因后得到的重组质粒。其中，mcherryp编码基因如seq id no.3所示。

21、在本发明的具体实施方式中，所述慢病毒包装质粒为pmd2g和pspax2。所述慢病毒包装细胞为293ft细胞。

22、在本发明的具体实施方式中，所述巨噬细胞为raw264.7细胞。

23、在上述方法中，所述tβr2-fc蛋白的编码基因可为如下任一：

24、(c1)seq id no.1或seq id no.1的第64-1257位所示的dna分子；

25、(c2)在严格条件下与(c1)限定的dna分子杂交且编码所述tβr2-fc蛋白的dna分子；

26、(c3)与(c1)-(c2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述tβr2-fc蛋白的dna分子。

27、上述编码基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

28、上述编码基因，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

29、上述编码基因中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

30、第二方面，本发明要求保护利用前文第一方面中所述的方法制备得到的表达tβr2-fc蛋白的巨噬细胞。

31、第三方面，本发明要求保护前文第二方面中所述表达tβr2-fc蛋白的巨噬细胞在制备用于预防和/或治疗肺纤维化的产品中的应用。

32、第四方面，本发明要求保护一种用于预防和/或治疗肺纤维化的产品。

33、本发明要求保护的用于预防和/或治疗肺纤维化的产品，含有前文第二方面中所述表达tβr2-fc蛋白的巨噬细胞。

34、其中，所述产品可为药物。

35、在本发明中的具体实施方式中，所述肺纤维化为博莱霉素(blm)诱导的小鼠肺纤维化。

36、本发明利用基因工程的方法构建表达tgf-βii型受体(tβr2)的重组质粒，包装慢病毒，感染raw264.7巨噬细胞，使其能持续稳定表达tgf-βii型受体(tβr2)，进而制备了表达tgf-βii型受体蛋白的巨噬细胞，即实施例中的慢病毒pcdh-rp-tβr2-fc感染的raw264.7细胞。实验证明，tgf-βii型受体蛋白可以有效拮抗纤维化诱导因子tgf-β的下游信号传导，防止纤维化发生。通过向博莱霉素染毒的肺纤维化小鼠肺内滴注工程化巨噬细胞raw-tβr2-fc，可以有效减轻小鼠肺纤维化程度。本发明将有助于肺纤维化治疗技术的发展，并推进以巨噬细胞为基础的细胞治疗方法在肺部疾病治疗中的应用。