一种富含高酶活糖化酶和阿魏酸酯酶的复合酶制剂及其菌株和应用的制作方法

本技术涉及微生物，尤其涉及一种含有高酶活糖化酶和阿魏酸酯酶的固体复合酶制剂及其菌株和应用。

背景技术：

1、酶是由动物、植物或微生物分泌产生的，具有催化能力高、专一性强、条件温和、能耗低、化学污染小等特点的高分子物质，其应用领域广，包括饲料、食品、纺织、皮革、医药以及新能源等方面。目前饲料工业中生产的酶制剂基本上都是采用微生物发酵法，生产方式有固态发酵和液态发酵。国内外常用的是液态发酵，其优势在于生产规模大，生产工人劳动强度小，机械化程度高，便于自动控制，容易获得高活力精品等。但是由于液态发酵酶系不丰富，废水污染严重等问题，越来越多的人开始关注酶制剂的固态发酵。随着国内外酶制剂行业的快速发展，固态发酵相对难控制的问题已经得到解决，而且，与液态发酵相比，酶系丰富，产量高，生产成本低和环境污染小等。但是固态发酵过程控制难，无法形成工业化、现代化发酵规模，需要进一步研究克服。

2、糖化酶是一种淀粉酶，属于外源性消化酶，可补充内源酶的不足，还能激活内源性消化酶的分泌，增强动物对饲料养分的消化吸收能力，从而提高畜禽生产性能和饲料利用率。同时，糖化酶可以直接水解营养底物，将饲料中的大分子物质水解为易吸收的小分子物质，降低营养物质在粪便中的排出量。阿魏酸酯酶是水解阿魏酸和半纤维素以及木质素之间酯键的酶，可以释放阿魏酸及其二聚体，同时也使这些多糖的酶解位点暴露出来，促进其降解。

3、黑曲霉(aspergillusniger)是一种常见的无毒性曲霉属真菌，生长旺盛，发酵周期短，发酵后能够产生多种生物酶。因此，探索以黑曲霉为菌种固态发酵生产多种生物酶复合酶制剂，尤其是富含高酶活的糖化酶和阿魏酸酯酶，具有一定的经济价值和社会意义。

技术实现思路

1、为了克服上述技术问题，本技术提供了一种含有高酶活糖化酶和阿魏酸酯酶的固体复合酶制剂及其菌株和应用，该固体复合酶制剂中糖化酶和阿魏酸酯酶产量好，酶活高，酶系广，能改善生猪的生长性能，提高生猪饲养的料肉比，提高养殖的经济效益。同时，本技术提供的复合酶制剂制备方法操作简单，技术要求低，可有效解决固态发酵过程的难以控制问题。

2、第一方面，本技术提供了一种富含高酶活糖化酶和阿魏酸酯酶的复合酶制剂，所述复合酶制剂由保藏号为cgmcc no:40501的黑曲霉pl-l2进行固体发酵制备获得。

3、本技术所述的黑曲霉pl-l2，分类命名为黑曲霉aspergillus niger，于2023年2月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.40501，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

4、进一步地，所述复合酶制剂含有糖化酶、阿魏酸酯酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、果胶酶、木聚糖酶、纤维素酶、β-甘露聚糖酶和半乳糖苷酶，所述糖化酶酶活80000-100000u/g，所述阿魏酸酯酶酶活500-600u/g。

5、采用上述技术方案，本技术提供的复合酶制剂中含有多种生物酶，酶系广，酶活高，尤其是其中糖化酶的酶活高达80000-100000u/g，阿魏酸酯酶的酶活高达500-600u/g。在日粮中添加外源性消化酶糖化酶，可以补充内源酶的不足，激活内源酶的分泌及活性。在木质纤维素降解过程中，阿魏酸酯酶作为一类高效的辅助酶，能够与其他纤维降解酶协同作用，促进粗饲料降解，改善动物健康和生产。因此，本技术提供的复合酶制剂能够作为饲料添加剂很好的应用于饲料降解中。

6、进一步地，所述酸性蛋白酶酶活22000-25000u/g、所述中性蛋白酶酶活500-700u/g、所述果胶酶酶活2000-3000u/g、所述木聚糖酶酶活900-1000u/g、所述纤维素酶酶活100-200u/g、所述β-甘露聚糖酶酶活100-200u/g和所述半乳糖苷酶酶活50-60u/g。

7、第二方面，本技术还提供了本技术第一方面所述的复合酶制剂的制备方法，包括将保藏号为cgmcc no:40501的黑曲霉pl-l2进行固体发酵。

8、进一步地，所述制备方法包括种子制备、接种固体培养基发酵。

9、进一步地，所述种子制备具体为将所述保藏号为cgmcc no:40501的黑曲霉pl-l2的斜面菌种配制成孢子悬浮液。

10、进一步地，所述孢子悬浮液的浓度为(0.8-1.5)*107个/ml。

11、进一步地，所述接种固体培养基发酵过程包括具体为，将所述孢子悬浮液接种至固体发酵培养基混合成曲，并置于30-35℃培养12-13d，期间不断翻曲和补料。

12、进一步地，所述固体发酵培养基为麸皮：豆皮质量比为(1.5-2.5):1。

13、所述翻曲具体为，第1-7d，堆积培养19h～21h后进行第一次翻曲，之后每经过11h～12h堆积培养进行一次翻曲，第8-13d，每隔19h～21h进行一次翻曲；每一次翻曲后根据含水量进行补水，使补水后含水量≤55％。

14、所述补料具体为，按照质量百分比计，第3天补9-11％麸皮和豆皮、0.4-0.6％葡萄糖和0.4-0.6％硫酸铵，第6天补9-11％底物、0.4-0.6％葡萄糖和0.4-0.6％硫酸铵，第9天补0.1-0.3％葡萄糖和0.1-0.3％硫酸铵。

15、采用上述技术方案，本技术在麸皮和豆皮的混合固体发酵培养基上接种保藏号为cgmcc no:40501的黑曲霉孢子悬浮液，并混合成曲，麸皮作为营养料提供营养，豆皮作为填充料起到通气作用。在发酵过程中翻曲是为了通风散热，曲霉生长会有呼吸热和发酵热，这时应补给新鲜空气，交换气体，排出二氧化碳，避免坏曲。在这个过程中补料可以为菌体的生长提供足够的养分，使菌体大量繁殖，从而获得所需的次级代谢产物。

16、进一步地，所述制备方法还包括发酵结束后，低温40-45℃烘干至水分≤10％，粉碎保存，即制得复合酶制剂。

17、第三方面，本技术还提供了一种由本技术第二方方面所述的制备方法制备得到的富含高酶活糖化酶和阿魏酸酯酶的复合酶制剂。

18、第四方面，本技术还提供了本技术第一方面所述的复合酶制剂或本技术第三方面所述的复合酶制剂在作为饲料添加剂的应用。本技术提供的复合酶制剂适用于各阶段猪只，添加比例为教槽料100-200g/t，保育料200-300g/t，中大猪料300-400g/t。

19、本技术相对于现有技术而言，具有以下技术效果：

20、1)本技术提供的复合酶制剂采用黑曲霉pl-l2经过固体发酵制得，该复合酶制剂产量好，酶活高，酶系广，尤其是其中含有糖化酶和阿魏酸酯酶，糖化酶的酶活高达80000-100000u/g，阿魏酸酯酶的酶活高达500-600u/g，可以有效降解纤维素，促进粗饲料的降解，提高饲料利用率，同时作为禽畜饲料添加剂应用于饲料中，可以改善动物的健康，有效降低料肉比，具有更好的应用前景。

21、2)本技术复合酶制剂的制备方法采用固体培养基发酵，同时结合翻曲和补料，制备方法操作简单，技术要求低，可有效解决固态发酵过程难以控制问题；同时，生产成本低，不需要灭菌，用霉用水少，环境污染小。