一种构建高表达难分泌蛋白的CHO细胞株的方法与流程

本发明涉及细胞株，具体为一种构建高表达难分泌蛋白的cho细胞株的方法。

背景技术：

1、培养哺乳动物细胞以高效的分泌方式产生重组蛋白，是一种获得重组蛋白理想的方式。cho细胞已经成为哺乳动物细胞的首选，因为它们具有类似于人的翻译后修饰蛋白的功能。然而想要持续高水平表达某特定的蛋白，如免疫球蛋白，仍然是有一定的困难，因为持续表达会导致产量降低，可能是细胞无法处理特定异源蛋白的合成或加工，从而引起细胞应激反应和细胞毒性效应。

2、哺乳动物细胞分泌蛋白质是一个复杂的途径，涉及多肽从细胞质转移到内质网(er)腔，在那里进行折叠和组装。蛋白质分泌的第一步依赖于信号肽，它是多肽氨基末端的一个特定序列，介导翻译核糖体与信号识别粒子(srp)的关联。srp的关联导致核糖体的翻译停止，并与内质网膜上的srp受体(sr)对接。随着新生的多肽通过转位子通道进入内质网腔，翻译继续开始。当srp复合物的功能不当，导致信号肽无法去除，多肽在内质网中沉淀的包涵体积累，并导致低分泌水平。如专利公布号cn111304243a《一种高效表达外源蛋白的cho细胞株的构建方法、构建的cho细胞株及其应用》公开了一种构建该信号肽序列和外源蛋白基因的表达质粒，然后转染cho细胞，逐步筛选稳定表达外源蛋白的单克隆细胞，无法让cho细胞中外源性蛋白的高效加工和分泌。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种构建高表达难分泌蛋白的cho细胞株的方法，有着高分泌和高表达的效果。

3、(二)技术方案

4、(1)将基因合成srp14的碱基序列，插入到质粒plvx-cmv-mcs-ires-puro的多克隆酶切位点，得到表达质粒载体plvx-cmv-srp14-ires-puro；

5、(2)将表达质粒进行检测分泌蛋白的表达水平后，再对其进行慢病毒包装，测出病毒的滴度后，用病毒去感染培养至对数生长期的cho细胞，培养2天后换液，用新的培养基培养2-4d，得到未药筛的多克隆cho-srp14的细胞株；

6、(3)将未药筛的多克隆cho-srp14的细胞株培养至对数生长期，用台盼蓝进行活细胞计数，然后细胞进行传代，离心换液，用含有20/ml嘌呤霉素的完全培养基继续培养，至未感染病毒的cho全部死亡，再将得到稳定的多克隆cho-srp14细胞株细胞株培养至对数生长期，得到单克隆cho-srp14细胞株。

7、进一步地，所述权利要求1步骤(2)慢病毒包装的步骤包括：

8、(1)包装前一天铺细胞

9、当293t细胞汇合率达到80％～90％时，过滤上清液加入磷酸缓冲盐溶液清洗，再加入胰蛋白酶，转动均匀分布在整个培养皿中，静止1-2min，再用移液枪吹打5-10次，用培养基稀释细胞悬液，取10-15ul加入到血球计数板，让细胞稀释到0.35-0.45×106cells/ml，得到的细胞悬液接种到另外一个皿中，摇匀后放入培养箱中培养；

10、(2)病毒上清液

11、当细胞传代24-36h后观察细胞汇合率达到70％～80％进行转染实验，转染前1-2h加入到条件一样的完全培养基中，配制后，用培养基将质粒和聚乙烯亚胺转染试剂分别稀释后静置5-10min，将聚乙烯亚胺转染试剂管加入到质粒管中，振荡混匀15-20s，再静置10-20min后加入到培养皿放入培养箱培养，16-18h后换液，加入等量的产毒培养基，再放入培养箱中，48-56h后将细胞上清液置于离心管中，离心3-5min，取上清液过滤膜；

12、(3)病毒浓缩

13、将病毒上清液移至浓缩管，离心10-15min，温度为3-6℃。

14、进一步地，所述权利要求1步骤(2)用病毒感染cho细胞时的条件为：0.65～0.75×106cells/ml，24孔板，500-550ul/孔。

15、进一步地，所述步骤(3)未药筛的多克隆cho-srp14的细胞株培养至对数生长期的条件为：细胞密度调至0.65～0.75×106cells/ml，加入终浓度为20ug/ml的嘌呤霉素，至六孔板中，转速为150-180rmp，温度为37℃，5％co2培养2-3d。

16、进一步地，所述步骤(3)稳定的多克隆cho-srp14细胞株细胞株培养至对数生长期的方法为：500xg的相对5离心力，时间为3-5min，离心后用新培养基重悬，进行细胞计数稀释到0.45-0.55cell/120ul/孔，用96孔板铺板，培养4-5d后排除多克隆的孔，培养7-8d后，加入培养液，培养14-16d后，细胞汇合度超过96孔板中底面积的40％～50％，将细胞吸出，养至24孔板，摇板培养。

17、进一步地，所述权利要求1步骤(1)磷酸缓冲盐溶液包括na2hpo4、kh2po4的一种。

18、(三)有益的技术效果

19、通过基因合成cho的srp14基因并构建质粒，得到plvx-cmv-srp14-ires-puro；将构建好的质粒与难表达的分泌蛋白一起共转cho细胞，以单独的分泌蛋白为对照，检测分泌蛋白的表达水平；再将plvx-cmv-srp14-ires-puro与慢病毒的两个包装质粒pspax2、pmd2.g同时转入293t细胞，形成包装好的慢病毒；将慢病毒进行浓缩纯化后，使其感染cho细胞，构建未药筛的多克隆cho-srp14的细胞株；随后进行药物筛选，用嘌呤霉素筛选，直至对照cho的细胞全部死亡(台盼蓝染色法)，获得阳性cho-srp14细胞株；多克隆cho-srp14细胞和cho细胞分别转染同一分泌蛋白，对比分泌蛋白的表达量；单克隆挑选：通过无限稀释的方法从多克隆cho-srp14细胞中挑选出单克隆，经培养获得单克隆cho-srp14细胞株；单克隆细胞株分别转染分泌蛋白，对比分泌蛋白的表达量，得到表达量最高的单克隆细胞株。

技术特征：

1.一种构建高表达难分泌蛋白的cho细胞株的方法，其特征在于：所述方法为：

2.根据权利要求1所述的构建高表达难分泌蛋白的cho细胞株的方法，其特征在于：所述步骤(2)慢病毒包装的步骤包括：

3.根据权利要求1所述的构建高表达难分泌蛋白的cho细胞株的方法，其特征在于：所述步骤(2)用病毒感染cho细胞时的条件为：0.65～0.75×106cells/ml，24孔板，500-550ul/孔。

4.根据权利要求1所述的构建高表达难分泌蛋白的cho细胞株的方法，其特征在于：所述步骤(3)未药筛的多克隆cho-srp14的细胞株培养至对数生长期的条件为：细胞密度调至0.65～0.75×106cells/ml，加入终浓度为20ug/ml的嘌呤霉素，至六孔板中，转速为150-180rmp，温度为37℃，5％co2培养2-3d。

5.根据权利要求1所述的构建高表达难分泌蛋白的cho细胞株的方法，其特征在于：所述步骤(3)稳定的多克隆cho-srp14细胞株细胞株培养至对数生长期的方法为：500xg的相对离心力，时间为3-5min，离心后用新培养基重悬，进行细胞计数稀释到0.45～0.55cell/120ul/孔，用96孔板铺板，培养4-5d后排除多克隆的孔，培养7-8d后，加入培养液，培养14-16d后，细胞汇合度超过96孔板中底面积的40％～50％，将细胞吸出，养至24孔板，摇板培养。

6.根据权利要求2所述的构建高表达难分泌蛋白的cho细胞株的方法，其特征在于：所述步骤(1)磷酸缓冲盐溶液包括na2hpo4、kh2po4的一种。

技术总结
本发明涉及细胞株技术领域，且公开了一种构建高表达难分泌蛋白的CHO细胞株的方法，构建质粒，得到plvx‑CMV‑SRP14‑IRES‑Puro；将plvx‑CMV‑SRP14‑IRES‑Puro与慢病毒的两个包装质粒psPAX2、pMD2.G同时转入293T细胞，得到的包装好的慢病毒进行浓缩纯化后，使其感染CHO细胞，构建未药筛的多克隆CHO‑SRP14的细胞株，用20ug/ml的嘌呤霉素筛选，直至对照CHO的细胞全部死亡(台盼蓝染色法)，获得阳性CHO‑SRP14细胞株群，单克隆挑选：通过无限稀释的方法从多克隆CHO‑SRP14细胞中挑选出单克隆，经培养获得单克隆CHO‑SRP14细胞株。

技术研发人员：张帆,李海兰,徐文正
受保护的技术使用者：江苏华抗生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15