一种ELISA抗体检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物检测，更具体地，本发明涉及一种小反刍兽疫病毒elisa抗体检测试剂盒，适用于小反刍动物生物样本中小反刍兽疫病毒抗体的检测。

背景技术：

1、小反刍兽疫(peste des petits ruminants，ppr)俗称羊瘟，一种由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，pprv)引起的急性传染病，是世界动物卫生组织(woah)规定的法定报告疫病，是fao-oie逐步控制跨界动物疾病五年行动计划中指出的重点疫病之一。

2、pprv属于副黏病毒科麻疹病毒属，有囊膜，结构上与牛瘟病毒、犬瘟热病毒、麻疹病毒等具有相似性。pprv基因组为单股负链rna，大小为15948nt，编码6种结构蛋白，分别为核衣壳蛋白(n)、基质蛋白(m)、大蛋白(l)、磷蛋白(p)、血凝素蛋白(h)、融合蛋白(f)，此外还有两种非结构蛋白(c和v)。

3、h基因全长1830nt，编码609个氨基酸。h蛋白属于病毒外层ii型糖蛋白，兼具血凝素和神经氨酸酶活性，在病毒吸附入侵过程中发挥重要作用，病毒首先通过h蛋白与细胞受体结合，然后在f蛋白的协助下进入细胞质。h蛋白是宿主免疫系统的主要目的抗原，也是产生中和抗体的重要抗原，广泛应用于亚单位疫苗的研发。pprv对外界环境抵抗力弱，对强酸、强碱、高温、紫外线等十分敏感，可用常规消毒剂杀灭。

4、ppr易感动物主要包括山羊、绵羊、羚羊等小反刍动物，也有牛、骆驼等动物感染的报告，可与山羊痘病毒和牛瘟病毒等病毒发生双重感染。本病主要传染源是患病动物或隐性感染者的分泌物和排泄物，潜伏期一般为3～10日，常表现为急性型，患病动物体温迅速升高至41℃，高烧持续3～5日，精神沉郁，厌食，口腔黏膜充血溃烂，可发展为坏死性口炎，眼鼻分泌脓性黏液，病畜逐渐消瘦脱水，部分伴有肺炎、咳嗽、腹式呼吸，严重时发病率可达100％，且病死率极高。根据临床症状可对ppr进行初步诊断，但其症状及病变与其他几种疫病颇为相似，因此需结合实验室诊断加以区分。

5、随着ppr全球控制和根除战略的有序进行，未来的疫苗发展趋势应当是各类基因工程疫苗逐步取代目前常用的pprv nigeria75/1弱毒苗和pprv sungri/96弱毒苗等活疫苗，从而在确保免疫效果的同时避免病毒扩散，逐步达到根除ppr的目的，同时为鉴别诊断提供可行性。在该大背景的影响下，开发与新型亚单位疫苗相配套的诊断技术尤为重要，特别是以蛋白/多肽为包被抗原，在保证特异性、敏感性优异的同时，可在试验过程中全程避免接触活毒。综上，研发此类pprv抗体检测试剂盒已是大势所趋，亦是在我国乃至全世界范围根除ppr行动中的重要环节。

6、目前，用于ppr的抗体检测方法主要有病毒中和试验(vnt)、阻断elisa、竞争elisa、间接elisa以及胶体金免疫层析技术。病毒中和试验是woah认定的国际贸易的金标准，具有较高的敏感性及特异性，能够区分ppr与牛瘟抗体，但流程复杂，耗时长，不适于大规模检测，且需接触活毒；elisa方法相较于vnt更易于在大规模的血清学调查中使用。阻断elisa及竞争elisa是基于单克隆抗体建立的抗体检测方法，高度依赖于单克隆抗体的筛选，且可能存在由于病毒变异造成单克隆抗体识别能力下降的风险，而间接elisa方法通常以重组表达蛋白或者多个表位多肽作为检测抗原，不但大大提升了检测的敏感性，且随着抗原制备技术的发展，特异性也得到大大提升，并且间接elisa能有效放大检测信号，大幅提升检测灵敏度，被广泛应用于pprv的抗体检测。

技术实现思路

1、本发明提供了一种用于检测小反刍兽疫病毒h蛋白抗体的间接elisa试剂盒及其使用方法，该试剂盒以小反刍兽疫病毒血凝素蛋白(h蛋白)上的抗原表位多肽为包被抗原，能快速检测生物样本中小反刍兽疫病毒抗体，优点在于特异性和敏感性高、操作便捷、检测成本低。

2、通常情况下，若以单条多肽为包被抗原，一般存在敏感性较低的问题，而较灵敏的多肽在特异性方面难以达到检测要求。为解决这一问题，本发明通过深入研究筛选出性能优异的小反刍兽疫病毒抗原表位多肽及其组合物，具体的小反刍兽疫病毒抗原表位多肽为序列表中序列1所示多肽、序列2所示多肽、或序列3所示多肽，所述组合物为序列表中序列1所示多肽、序列2所示多肽和序列3所示多肽两种或两种以上任意组合。当所述多肽组合物为序列1所示多肽、序列2所示多肽、序列3所示多肽的其中两种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)∶(0.5～1.5)，优选的，其质量比为1∶1；当所述多肽组合物为序列1所示多肽、序列2所示多肽、序列3所示多肽的其中三种时，三种多肽的质量比为(0.5～1.5)∶(0.5～1.5)∶(0.5～1.5)，优选的，其质量比为1∶1∶1。

3、本发明的小反刍兽疫病毒elisa抗体检测试剂盒，具体包括：酶联反应板、20×浓缩洗涤液、样品稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、底物液a、底物液b、终止液。

4、其中所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板,包被有化学方法人工合成的小反刍兽疫病毒抗原表位多肽组合物。

5、所述酶联反应板的制备方法是将小反刍兽疫抗原表位多肽组合物溶于ph9.6的碳酸盐缓冲液中，混合均匀后加入96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔加入浓度为2μg/ml的多肽或多肽组合物100μl，置于2～8℃环境中8～12h，使包被物充分吸附于酶联反应板。包被完成后，每孔加入浓度为5mg/ml的牛血清白蛋白(bsa)pbs缓冲液(ph7.4)300μl，37℃封闭处理2h，取出甩干，充分干燥后于2～8℃密封保存。

6、所述20×浓缩洗涤液为含有1％tween20的0.01mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.4)。

7、所述样品稀释液为含有5g/l酪蛋白的0.01mol/l的磷酸盐缓冲液(ph7.4)。

8、所述阳性对照血清是以小反刍兽疫商品化活疫苗为免疫原，注射山羊三次提取制备的高免血清，经样品稀释液一定程度稀释后，制成阳性对照血清。

9、所述阴性对照血清为无小反刍兽疫感染或免疫的健康山羊血清。

10、所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗羊igg抗体。

11、所述底物液a为含有0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液b为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用前需将两者1∶1混匀。

12、所述终止液为2mol/l的h2so4。

13、本发明的试剂盒适用于小反刍动物(具体对象为山羊或绵羊)生物样本(通常为血清或血浆)中小反刍兽疫病毒抗体(igg)的检测。通常来说，若存在该抗体提示该动物受小反刍兽疫病毒感染或接种小反刍兽疫疫苗后产生免疫应答。

14、本发明的小反刍兽疫病毒elisa抗体检测试剂盒具体使用方法为：

15、(1)检测前将试剂盒各组分平衡至室温；

16、(2)将试剂盒配备20×浓缩洗涤液用去离子水或蒸馏水以1∶20稀释；

17、(3)取酶联反应板(可根据样品数量分多次使用)，每次检测应设阳性对照孔2个，阴性对照孔2个，以及适量空白对照孔，其余为待检血清孔；

18、(4)使用样品稀释液将待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清按1∶20比例稀释；

19、(5)在待检血清孔、阳性对照孔、阴性对照孔每孔加入稀释好的对应血清100μl；

20、(6)加样完毕后，振荡混匀，37℃孵育30min；

21、(7)取出反应板甩干，每孔加稀释后的洗涤液300μl，轻微振荡后弃去洗涤液，洗板3～4次，在吸水纸上拍干；

22、(8)每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记兔抗羊igg抗体；

23、(9)加样完毕后，振荡混匀，37℃孵育30min；

24、(10)取出反应板甩干，每孔加稀释后的洗涤液300μl，轻微振荡后弃去洗涤液，洗板3～4次，在吸水纸上拍干；

25、(11)将底物液a和底物液b按1∶1比例混匀，每孔加入混匀后的底物液100μl，37℃避光显色15min；

26、(12)每孔加入50μl的终止液；

27、(13)用酶标仪读取每孔的od450nm值。

28、本发明的小反刍兽疫病毒elisa抗体检测试剂盒检测结果判定方法为：

29、(1)当阴性对照孔od450nm平均值≤0.15，阳性对照孔每个值在1.0～2.5之间时结果成立，否则该次结果无效；

30、(2)计算临界值：临界值＝0.15×阳性对照孔od450nm平均值；

31、(3)待检血清od450nm≥临界值，抗体阳性；待检血清od450nm<临界值，抗体阴性。

32、本发明采用生物信息学方法分析小反刍兽疫病毒血凝素蛋白(h蛋白)的优势抗原表位，筛选出性能优异的多肽组合物，能快速检测生物样本中的小反刍兽医病毒抗体，具有灵敏度高、特异性强、重复性好的优势。

33、本发明采用固相合成技术合成多肽，合成后的肽纯度高且性质稳定；以由于化学合成多肽作为包被抗原，避免了与活毒接触，能有效去除杂蛋白的干扰，提高检测的特异性，从而降低假阳性的概率。

34、随着fao-oie小反刍兽疫全球根除计划的逐步开展，许多涉及小反刍兽疫病毒亚单位疫苗的研究正在步入正轨，显现出逐步取代主流活疫苗的趋势。本发明的小反刍兽疫病毒elisa抗体检测试剂盒能准确检测山羊、绵羊等小反刍动物体内小反刍兽疫病毒抗体存在情况，未来可配套相关亚单位疫苗使用，从而精准区别免疫动物和感染动物，有利于我国乃至全世界范围内小反刍兽疫根除工作的推进。