一种用于假小链双歧杆菌的定量检测方法及其核酸检测试剂盒与流程

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种用于假小链双歧杆菌的定量检测方法及其核酸检测试剂盒。

背景技术：

1、假小链双歧杆菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)是属于放线菌门(actinobacteria)、双歧杆菌属(bifidobacterium)的常见菌种，普遍存在于人和动物肠道以及污水等环境样品中。在人体肠道中，假小链双歧杆菌能在人生命早期定植，并持续稳定存在。在新生儿出生一周左右，婴儿粪便中就可检测到假小链双歧杆菌，婴儿断奶后其丰度能显著增加并逐渐趋于稳定，是成年人和中国健康老人肠道双歧杆菌的优势菌种。

2、研究发现，假小链双歧杆菌在糖脂代谢、炎症反应和神经系统等方面均有改善效果，还能产生或转化多种具有生物活性的物质，如植酸酶、β-葡萄糖苷酶、叶酸等。作为人体肠道中主要的有益菌种，对假小链双歧杆菌的含量进行定量检测，有助于快速评估机体及其微生态的健康状态，从而发现人体在成长过程中(尤其是生命早期)可能将面临的健康隐患，预防相关疾病问题。

3、由于双歧杆菌的菌种种类较多，而益生菌产业化的相关菌种则相对较少，因此长期以来，人们往往重点关注在长双歧杆菌(b.longum)、短双歧杆菌(b.breve)、动物双歧杆菌(b.animalis)等“明星”菌种，或是仅仅对双歧杆菌属水平(genus level)的种群进行总体检测评估，对于同样具有重要生态功能的假小链双歧杆菌等种水平(species level)的菌种，则缺乏相应的研究报道。目前仍主要依靠普通聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，pcr)方法进行定性检测，但该方法灵敏度低，且无法对假小链双歧杆菌进行有效的定量；针对假小链双歧杆菌进行定性检测的基因主要还是基于传统的16srrna基因，但16s rrna基因在细菌物种鉴定上是通行检测基因，在细菌属水平以下的种及亚种水平上缺乏足够的分辨率。另一方面，虽然国外近年来已有少数研究开始关注到假小链双歧杆菌等其它种类的双歧杆菌菌种，但研究所设计的引物主要针对于乳制品等食品中的双歧杆菌检测，尚未在粪便等更广泛来源的样本中进行试验评估，因而很有必要建立具备更好的特异性、且能应用于各类样本来源的假小链双歧杆菌定量检测的普适化方法。

4、比较基因组学是基于物种基因组图谱和全基因组测序结果，对已知的基因和基因组结构进行比较，来探究基因的功能、作用机制和物种进化的学科。通过对不同亲缘关系物种的基因组序列进行比较，能够鉴定出编码序列、非编码调控序列及给定物种独有的序列。而基因组范围之内的序列比对，可以了解不同物种在核苷酸组成、同线性关系和基因顺序方面的异同，进而得到基因分析预测与定位、生物演化关系等方面的信息。

5、荧光定量pcr(real-time quantitative pcr，qpcr)是1996年由美国appliedbiosystems公司首先推出的技术，该技术不仅实现了pcr从定性到定量的飞跃，而且与常规pcr相比，它具有特异性更强、有效解决pcr污染问题、自动化程度高等特点，实现了pcr结果的实时监测，推动了分子诊断技术的发展。相比于普通pcr，荧光定量pcr对引物的特异性与灵敏度要求更高，一般有相对定量和绝对定量两种测定方法。相对定量是用于测定两个或多个不同样品中靶基因量的差异，得到的数据是目的基因在各样本中含量的相对比例。即将实验样本中靶基因的ct值与对照样本的ct值进行比较，比较结果以实验样本中靶基因量与对照样本中靶基因量的比值或差异倍数来表示。该方法在定量检测mrna水平中最常见，研究生理变化对基因表达水平的影响，方法简单可靠，但只能获得不同样本间的基因表达量的差异倍数，无法知晓每个样本中的表达量真实值。而绝对定量qpcr则能精确计算样品中目的基因的初始浓度，比如测定血液样品中病毒颗粒数(dna或rna)、细胞中基因的拷贝数、微生态群落样品中特定基因或菌种的含量等。该方法的关键在于对事先制备好的已知目的基因浓度的一系列标准品进行检测，从而获得各个浓度梯度对应的检测荧光值，以此拟合得到标准曲线，从而对待检样品中的目的基因浓度做到精确定量，因而对于引物的设计和标准品的制备都有更高的要求。

6、因此，此发明旨在建立一种基于qpcr技术的稳定、准确的假小链双歧杆菌绝对定量检测方法。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种用于检测假小链双歧杆菌的高特异性、高灵敏度的引物对。

2、本发明还要解决的技术问题是提供了引物对扩增得到的基因片段。

3、本发明还要解决的技术问题是提供了一种阳性标准质控品。

4、本发明还要解决的技术问题是提供了一种检测试剂盒。

5、本发明还要解决的技术问题是提供了所述的特异性引物对、所述的基因片段、所述的阳性标准质控品、所述的试剂盒在检测假小链双歧杆菌的应用。

6、本发明最后要解决的技术问题是提供了一种检测假小链双歧杆菌的方法。

7、技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了检测假小链双歧杆菌的特异性引物对，所述特异性引物对包括正向引物pse-08.4f和反向引物pse-08.4r，所述正向引物pse-08.4f的序列如seq id no.1所示，所述反向引物pse-08.4r的序列如seq id no.2所示。

8、本
技术实现要素：
还包括所述的引物对扩增得到的基因片段，其核苷酸序列如seq idno.3所示。

9、本发明内容还包括一种阳性标准质控品，其核苷酸序列如seq id no.4所示。

10、本发明内容还包括一种检测假小链双歧杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。

11、其中，所述试剂盒还包括所述的基因片段或所述的阳性标准质控品。

12、其中，所述试剂盒还包括荧光定量pcr所需其他试剂。

13、本发明内容还包括所述的特异性引物对、所述的基因片段、所述的阳性标准质控品、所述的试剂盒在检测假小链双歧杆菌的应用。

14、本发明内容还包括一种检测假小链双歧杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：

15、1)假小链双歧杆菌基因组dna和样本中微生物组总dna的提取；

16、2)分别采用所述的特异性引物对，分别以制备的不同拷贝数浓度梯度的质粒作为标准品和粪便微生物组总dna为模板，进行qpcr实验，根据标准阳性质粒的检测ct值建立标准曲线，根据标准曲线，进一步计算粪便微生物组总dna样品中，目的片段所代表的假小链双歧杆菌的拷贝数。

17、其中，所述样本包括但不仅限于粪便、母乳、其他食品或污水环境来源的样品。

18、其中，步骤1)中qpcr实验体系(20μl)和所述的qpcr实验的条件如下：

19、 反应物名称 用量 2×chamq universal sybr qpcr master mix 10μl 正向引物pse-08.4f(10μm) 0.4μl 反向引物pse-08.4r(10μm) 0.4μl dna模板 1μl <![cdata[ddh₂o]]> 补至20.0μl

20、

21、有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：

22、1、通过泛基因组和核心基因组分析，建立了特定菌种的基因组特异性序列筛选方法，并应用于假小链双歧杆菌特异性引物对的设计，且该引物具备良好的特异性及灵敏度，可用于复杂微生态群落样本的检测，灵敏度达到100拷贝/检测孔。

23、2、实现了假小链双歧杆菌在种水平的绝对定量检测，将该检测方法应用于微生态样品的检测，并具备良好的特异性和灵敏度。

24、3、本发明提供了一种适用于qpcr检测的质粒标准品的快速、简易、高效的设计和构建方法。

25、4、本发明提供了针对qpcr扩增中非特异性扩增产物干扰的解决办法，通过改变读取荧光信号强度的起始温度，能有效避免非特异性扩增产物荧光信号对于绝对定量检测结果的影响。

26、本发明的绝对定量检测方法可应用于含有假小链双歧杆菌的微生物群落样品，所述样品包括但不限于粪便、母乳、各类食品及污水等环境来源样品，应用范围广，稳定性和特异性高。