一种双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法

本发明属于酶工程和生物工程，具体涉及到一种双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法。

背景技术：

1、淫羊藿素又名淫羊藿苷元，具备多种药理活性，目前已经作为一类抗肝癌新药(淫羊藿素软胶囊)上市。作为一种小分子免疫调节剂，淫羊藿素用于晚期肝细胞癌(hcc)一线治疗。但因为淫羊藿素在淫羊藿体内的含量极低，极大的限制了其在临床中的应用，分析淫羊藿总黄酮的结构发现，朝霍定a/b/c、淫羊藿苷、宝霍苷i与淫羊藿素母核一致，可通过去除相应位置的鼠李糖、葡萄糖和木糖将其转化为淫羊藿素。利用糖苷酶定向水解相应的糖基是生物转化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿素的有效途径。

2、糖苷酶是一种能够特异性地水解多种糖苷键型的外切糖苷水解酶，如α-l-鼠李糖苷酶(α-l-rhamnosidase，ec 3.2.1.40)能够水解许多天然的植物提取成分，如柚皮苷、朝霍定c、淫羊藿苷等糖苷类物质；β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，ec 3.2.1.21)可以在带有芳香基团或烷基的碳水化合物的残基之间打断β-1,4-糖苷键，因而被广泛应用黄酮类化合物和皂苷类等天然活性物质的生物催化和转化等领域。β-木糖苷酶(1,4-β-d-xylosidase，ec 3.2.1.37)也被越来越多地应用于植物资源中带有木糖基的天然活性物质(如萜类、黄酮类、甾体类化合物)的生物转化，进而获得更强药理活性的天然产物衍生物。但糖苷酶的专一性、催化活性及使用成本是其能否运用到特定化合物制备技术中的关键。

3、众所周知，游离酶通常只能使用一次；同时游离酶与产物分离相对比较困难，增加了制备成本。研究表明，通过固定化酶技术，不仅可改善酶的一些催化性能，而且可以实现酶的重复使用，降低酶的使用成本。固定化酶的方法有共价结合、吸附、交联和包埋等。但不同性质的酶其固定化方法及固定化效果差异很大因此，针对特定的酶及特定化合物的制备工艺，发明酶的固定化新方式、提高酶的固定化效率和酶的重复利用次数是利用生物酶定向脱除淫羊藿总黄酮中的糖基高效、低成本和规模化制备淫羊藿苷元的有效途径。

技术实现思路

1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

3、本发明的其中一个目的是提供一种双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法，实现了将淫羊藿总黄酮全部转化为淫羊藿苷元，本发明大大缩短了淫羊藿苷元的制备工艺，提高了生产效率。

4、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法，包括，

5、在缓冲体系中，将第一固定化酶与底物淫羊藿总黄酮反应；

6、反应后移除第一固定化酶，并加入第二固定化酶继续反应，得到淫羊藿素；

7、其中，所述第一固定化酶为α-l-鼠李糖苷酶dtrha与环氧基树脂载体通过共价键连接得到；

8、所述固定化酶为多功能糖苷酶tpebgl3由连接肽介导与沸石载体通过特异性吸附连接得到。

9、作为本发明双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法的一种优选方案，其中：所述底物淫羊藿总黄酮与所述第一固定化酶的质量比为1～6:1；

10、所述底物淫羊藿总黄酮与所述第二固定化酶的质量比为1～5:1。

11、作为本发明双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法的一种优选方案，其中：所述第一固定化酶的加酶量为0.25～1.50u/ml，所述第二固定化酶的加酶量为5～30u/ml。

12、作为本发明双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法的一种优选方案，其中：所述缓冲体系为na2hpo4-柠檬酸缓冲液体系，所述缓冲体系的浓度为50mmol/l，所述缓冲体系的ph为5.5。

13、作为本发明双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法的一种优选方案，其中：所述反应，反应温度为75～95℃，ph为4.5～8.0，反应时间为8～24h。

14、作为本发明双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法的一种优选方案，其中：所述环氧基树脂包括esiud301、lx-1000ep、lx-103b、e3bvd900、hfa、lx-ep、es-103b、es-107和es-1中的一种；每克所述环氧基树脂载体上所述α-l-鼠李糖苷酶dtrha的负载量为30～80u。

15、作为本发明双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法的一种优选方案，其中：所述通过共价键连接，将第一缓冲液与α-l-鼠李糖苷酶dtrha混合形成缓冲酶液；将所述缓冲酶液与环氧基树脂载体混合进行固定化反应后用蒸馏水洗涤并抽滤得到第一固定化酶。

16、作为本发明双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法的一种优选方案，其中：所述第一缓冲液为na2hpo4-柠檬酸第一缓冲液，所述第一缓冲液的浓度为250～1750mmol/l，所述第一缓冲液的ph为4.0～8.0；所述α-l-鼠李糖苷酶dtrha的酶负载量为2～20mg/g；所述固定化时间为2～16h。作为本发明双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法的一种优选方案，其中：所述沸石包括na-y沸石、β-沸石、2go-沸石和100y-沸石中的一种；每克所述沸石载体上所述多功能糖苷酶tpebgl3的负载量为1100～1400u；

17、所述连接肽为4lp序列，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

18、作为本发明双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法的一种优选方案，其中：所述通过特异性吸附连接，将多功能糖苷酶tpebgl3与连接肽融合；加入第二缓冲液形成缓冲酶液；将所述缓冲酶液与沸石载体混合进行固定化反应后用第二缓冲液洗涤、离心，得到第二固定化酶。

19、作为本发明双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法的一种优选方案，其中：所述第二缓冲液为na2hpo4-柠檬酸第二缓冲液，所述第二缓冲液的浓度为25～400mmol/l，所述第二缓冲液的ph为4.0～8.0；所述多功能糖苷酶tpebgl3与连接肽融合表达的酶负载量为1～10mg/g；所述固定化时间为0.5～5.0h。

20、作为本发明双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法的一种优选方案，其中：所述缓冲体系中还含有疏水共熔溶剂，所述疏水共熔溶剂为加热由氢键受体与氢键供体的混合物而形成的均匀透明的液体；

21、所述氢键供体包括己酸、辛酸、正丙醇、癸醇和正十二醇中的一种；所述氢键受体为百里香酚；

22、所述氢键受体与所述氢键供体的摩尔比为1:2。

23、作为本发明双固定化酶联用制备淫羊藿素的方法的一种优选方案，其中：所述疏水共熔溶剂与na2hpo4-柠檬酸缓冲液的体积比为1:4～4:1。

24、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

25、本发明以嗜热菌thermotoga petrophila dsm 13995来源的多功能糖苷酶tpebgl3(β-d-葡萄糖苷酶和β-d-木糖苷酶活性)和嗜热菌dictyoglomus thermophilumdsm 3960来源的α-l-鼠李糖苷酶dtrha两种优良的酶为固定化对象，将tpebgl3与4lp连接肽融合表达后与na-y沸石进行特异性吸附固定，将dtrha与环氧基树脂es-107进行共价固定，获得了稳定性和重复利用性良好的固定化酶4lp-tpebgl3@na-y和dtrha@es-107，并建立了固定化酶最佳制备条件，有效解决了这两种酶，特别是鼠李糖苷酶dtrha难固定、固定化效率低、重复利用次数少等难题。同时，本发明筛选了理想的疏水深共熔溶剂用于构建双相体系，通过固定化酶4lp-tpebgl3@na-y和dtrha@es-107的联用，实现了将淫羊藿总黄酮全部转化为淫羊藿苷元，本发明大大缩短了淫羊藿苷元的制备工艺，提高了生产效率；且反应过程中不需要添加强还原剂、氧化剂及强酸等试剂，降低了环境污染，适宜于工业化生产。