靶向BCMA抗体及其相关产品和医药用途的制作方法

本发明属于生物、生物医药领域，具体涉及靶向bcma抗体及其相关产品和医药用途。

背景技术：

1、bcma(b cell maturation antigen，即cd269)全称为b细胞成熟抗原，是肿瘤坏死因子受体(tnf)超家族的成员，可结合b细胞激活因子和增殖诱导配体，优先在成熟b淋巴细胞中表达，多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)癌症细胞上bcma的表达水平显著高于健康的浆细胞。越来越多的证据表明，bcma是用于治疗多发性骨髓瘤的合适的靶抗原之一。

2、由于伦理的限制，抗体的筛选不能用人体来做筛选。因此，目前抗体的筛选都是基于试验动物获得，比如：小鼠，兔子，羊驼等等。小鼠的筛选成本最低，因此应用最为广泛，所以获得的抗体大多数都是鼠源的。近年来单抗类药物，以及后续car-t、car-nk细胞免疫治疗手段的涌现，以试验动物为基础的抗体筛选应用范围进一步扩大。随着单抗、car-t、car-nk细胞产品的广泛应用，研究人员发现直接应用鼠源等动物来源的抗体及嵌合抗原受体(car)，进入人体后，被人体的免疫系统视作异种、异源蛋白，会产生明显的抗原抗体反应，人体内会出现大量的抗体，进而影响到鼠源抗体在人体内的治疗效果。解决这个问题的一个有效途径就是利用生物信息学的数据及知识，对筛选出来的鼠源抗体的核酸序列进行密码子的优化，使其更符合在人体内的表达习惯。同时再利用生物信息学的算法，在不改变cdr区域的前提下，对抗体的框架区进行人源优化，最终使鼠源抗体的序列尽可能转变成接近人体内天然的抗体序列。进行上述优化以后的抗体就称为人源化抗体，在人体内不会出现明显的抗原抗体反应，保证了抗体药物、car-t、car-nk最大的治疗效果。

技术实现思路

1、本发明首先通过筛选试验获得了鼠源的靶向bcma抗原的鼠源抗体序列，对鼠源抗体序列进行优化后获得了数个人源化的靶向bcma抗原的scfv抗体序列。再构建包含该抗体的嵌合抗原受体，并将该嵌合抗原受体转导进入人的nk细胞，成功制备了car-nk细胞，该car-nk细胞在体内外实验中都取得了很好的治疗效果。通过人源化抗体所获得的car-nk细胞的阳性率稳定性和杀伤能力均高于鼠源抗体。

2、具体地，本发明提供了以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种靶向bcma的抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含可变轻链和可变重链，

4、所述可变轻链中包含轻链cdr1、轻链cdr2、轻链cdr3，所述轻链cdr1序列如seqno.1所示，所述轻链cdr2的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述轻链cdr3如seq id no.3或seq id no.4所示；

5、所述可变重链中包含重链cdr1、重链cdr2、重链cdr3；所述重链cdr1序列如seqno.5所示，所述重链cdr2的氨基酸序列如seq id no.6所示，所述重链cdr3如seq id no.7或seq id no.8所示。

6、优选地，所述抗体还包括轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3、轻链fr4、重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4。

7、优选地，所述轻链fr1可以如seq id no.9-10任一所示。优选地，所述轻链fr2可以如seq id no.11-12任一所示。优选地，所述轻链fr3可以如seq id no.13-14任一所示。优选地，所述轻链fr4可以如seq id no.15-16任一所示。优选地，所述重链fr1可以如seq idno.17-18任一所示。优选地，所述重链fr2可以如seq id no.19-21任一所示。优选地，所述重链fr3可以如seq id no.22-24任一所示。优选地，所述重链fr4可以如seq id no.25-26任一所示。

8、优选地，所述抗体的链接方式是可变轻链-连接子-可变重链。

9、更优选地，所述抗体是人源化的。具体地，所述人源化抗体的表达更稳定，对靶细胞的杀伤性更强。

10、更优选地，所述抗体的完整序列如seq id no.28-35所示。

11、如本文所用，术语“抗原结合片段”是指由抗体的一部分形成的抗体片段，其包含一或多个cdr或与抗原结合但不包含完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双功能抗体、fab、fab'、f(ab')2、fv片段、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性dsfv(dsfv-dsfv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scfv)、scfv二聚体(二价双功能抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合片段能够结合至与亲本抗体所结合相同的抗原。

12、更优选地，所述抗体进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。

13、另一方面，本发明提供了一种抗体复合物，所述抗体复合物是在前述抗体或其抗原结合片段的氨基端和/或羧基端以肽键连接结构域所构成的。

14、优选地，所述结构域包括铰链区、跨膜结构域和/或信号转导结构域。

15、优选地，所述信号转导结构域包含共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。

16、优选地，所述铰链区包括cd8铰链区、cd28铰链区、cd4铰链区、cd5铰链区、cd134铰链区、cd137铰链区、icos铰链区中的一种或多种的组合。

17、优选地，所述铰链区是cd8铰链区，其氨基酸序列如seq id no.45所示。

18、优选地，所述跨膜结构域包括蛋白质的跨膜结构域，所述蛋白质包括：2b4基因表达的蛋白、t细胞受体的α、β或ζ链，cd28，cd3ε，cd45，cd4，cd5，cd8，cd9，cd16，cd22，cd33，cd37，cd64，cd80，cd86，cd123，cd134，cd137和cd154。

19、优选地，所述跨膜结构域是cd8跨膜结构域，其氨基酸序列如seq id no.46所示。

20、优选地，所述共刺激结构域包括4-1bb、2b4、cd3ζ、ox40、cd2、cd27、cd28、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)和4-1bb(cd137)的功能性信号传导结构域。

21、优选地，所述共刺激结构域是4-1bb共刺激结构域，其氨基酸序列如seq id no.47所示

22、优选地，所述胞内信号传导结构域包括cd3-ζ、fcεriγ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的一种蛋白或多种蛋白的任意组合的信号传导区。

23、优选地，所述胞内信号传导结构域的氨基酸序列如seq id no.48所示。

24、更优选地，所述抗体复合物即为嵌合抗原受体(car)。

25、优选地，所述结构域还包括信号肽。

26、优选地，本发明选用cd8信号肽进行测试。

27、如本文所用，嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)是一种人工合成的受体，能引导免疫细胞特异性地追踪识别和清除表达相关靶配体的肿瘤细胞，通常由能够识别肿瘤相关抗原的胞外结合域(一般来自单抗的抗原结合区的scfv片段)、铰链域、跨膜域和胞内信号结构域，具有高度靶向性。

28、另一方面，本发明提供了一种编码前述抗体的核酸分子。

29、优选地，所述核酸分子如seq id no.37-44所示。

30、另一方面，本发明提供了一种编码前述抗体复合物的核酸分子。

31、另一方面，本发明提供了一种载体，所述载体包含前述编码抗体的核酸分子和/或前述多肽复合物dna分子，或者，所述载体表达前述靶向bcma的抗体或其抗原结合片段，或，抗体复合物。

32、优选地，所述载体是表达载体。

33、优选地，所述载体是病毒表达载体。

34、优选地，所述病毒表达载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒表达载体或其他类型病毒载体。

35、另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含前述抗体、前述多肽复合物、前述编码抗体的dna分子、前述多肽复合物的dna分子和前述载体中的一种或多种。

36、优选地，所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。

37、优选地，所述原核细胞是细菌细胞，如农杆菌、大肠杆菌。

38、优选地，所述细菌细胞包括革兰氏阴性微生物和革兰氏阳性微生物。

39、优选地，所述真核细胞是真菌细胞，即酵母细胞。

40、优选地，所述真核细胞是动物细胞、昆虫细胞、植物细胞。

41、优选地，所述动物细胞包括人源细胞或非人源的细胞。

42、优选地，所述人源细胞是免疫细胞。

43、优选地，所述免疫细胞包括t细胞、b细胞、k细胞和nk细胞中的一种或多种。

44、优选地，所述免疫细胞是nk细胞或t细胞。

45、优选地，所述免疫细胞是自体或异体的。

46、优选地，所述免疫细胞来源于外周血(pb)、脐带血(ucb)、人类胚胎干细胞(hesc)、诱导多能干细胞(ipsc)或商品化细胞系。

47、另一方面，本发明提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包含前述抗体，还包含选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子或酶。

48、另一方面，本发明提供了一种治疗bcma相关疾病的药物组合物，所述药物组合物中含有前述抗体或其抗原结合片段、前述抗体复合物、编码前述抗体的核酸分子、编码前述抗体复合物的核酸分子、载体、宿主细胞、抗体偶联物中的一种或多种；和/或药学上可接受的载体。

49、优选地，所述药物组合物中还可以包含其他活性成分，如舒尼替尼(sunitinib，sutent)、易瑞沙(iressa、吉非替尼片)、它赛瓦(tarceva，特罗凯)、赫赛汀(herceptin，trastuzumab)、阿瓦斯汀(avastin，bevacizumab)、三氧化二砷、反式维甲酸、万珂(velcade，bortezomib)、替莫胺(temodar)、爱必妥(erbitux，cetuximab)、大沙替尼(dasatinib sprycel)、索拉非尼(sorafenib，nexavar)、巾白尼单抗(vectibix，panitumumab)、替吉奧(ts-1)、ixempra(ixabepilone)等。

50、优选地，所述药物组合物中还可以包含药学上可接受的辅料。

51、优选地，所述药学上可接受的辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、ph调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

52、优选地，所述药物联用组合物的剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。

53、另一方面，本发明提供了一种检测bcma的方法，所述方法包括将前述抗体或其抗原结合片段与待检测样品接触的步骤。

54、优选地，所述抗体或其抗原结合片段是具有可检测标记的抗体。

55、优选地，所述可检测标记包括酶、荧光材料、发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。

56、优选地，所述方法还包括检测待测样品与抗体结合后的反应的步骤。

57、优选地，所述待测样品包括生理体液，所述生理体液包括血液、血清、血浆、唾液、眼睛分泌物、脑脊液、脓、渗出液、乳汁、汗液、眼泪、耳流出物、痰、淋巴液、尿液、粪便；所述待测样品还包括组织，所述组织包括肺、脾和肾。

58、优选地，所述待测样品中含有b细胞。

59、优选地，所述检测是非诊断目的的。

60、另一方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用前述抗体或其抗原结合片段、前述多肽复合物、编码前述抗体的核酸分子、编码前述抗体复合物的核酸分子、前述载体、前述宿主细胞或前述药物组合物。

61、优选地，所述施用方式包括肠道给药或非肠道给药，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔黏膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

62、最优选地，所述癌症是多发性骨髓瘤(mm)。

63、优选地，所述治疗的方法还可以与其他治疗方式例如：化学疗法、放射疗法、免疫疗法、基因疗法、外科手术等。

64、另一方面，本发明提供了前述抗体或其抗原结合片段、前述多肽复合物、编码前述抗体的核酸分子、编码前述抗体复合物的核酸分子、前述载体、前述宿主细胞或前述药物组合物中任意一种或多种在结合bcma中的应用。

65、另一方面，本发明提供了前述抗体或其抗原结合片段、前述多肽复合物、编码前述抗体的核酸分子、编码前述抗体复合物的核酸分子、前述载体、前述宿主细胞或前述药物组合物中任意一种或多种在制备治疗癌症或表达bcma的免疫细胞介导的免疫病症的药物中的应用。

66、优选地，所述癌症包括浆细胞恶性肿瘤或b细胞恶性肿瘤。

67、优选地，所述癌症包括白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。

68、优选地，所述癌症包括bcma高表达相关的癌症。

69、最优选地，所述癌症包括多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)、霍奇金淋巴瘤、白血病、胶质母细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin's lymphoma，nhl)、骨髓发育异常综合症(mds)、骨髓增生综合症(mps)、mgus(意义未明的单克隆丙种球蛋白病，monoclonalgammopathy of undetermined significance)、孤立性浆细胞瘤(solitaryplasmacytoma)、waldenstrom巨球蛋白血病(macroglobulinemia)、原发性系统性淀粉样变性(al amyloidosis)、浆细胞白血病(plasma cell leukemia)、伯基特氏淋巴瘤(burkett's lymphoma)

70、最优选地，所述癌症是多发性骨髓瘤(mm)。

71、优选地，所述免疫细胞是b细胞。

72、优选地，所述免疫病症包括类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮(sle)、i型糖尿病、哮喘、异位性皮炎、过敏性鼻炎、血小板减少性紫癜、多发性硬化症、牛皮癣、修格兰氏综合症、桥本氏甲状腺炎、格雷夫氏病、原发性胆汁性硬化、韦格纳氏肉芽肿病、结核病以及移植物抗宿主疾病。