一种经磷酸化和去磷酸化修饰获得的o2突变体及其用途

本发明属于生物工程，具体涉及一种经磷酸化和去磷酸化修饰的o2突变体过表达材料及其用途。

背景技术：

1、玉米籽粒最主要的储藏蛋白为醇溶蛋白，醇溶蛋白缺乏必需氨基酸—赖氨酸和色氨酸，导致玉米不管作为饲料还是食用，营养品质都很差。为提升我国玉米产业，就籽粒而言，在不影响产量或增加产量的同时，不断改善营养品质为必经之路，也是玉米遗传育种长期的奋斗目标。

2、玉米品质改良起始于发现opaque2(o2)突变体具有高营养品质。上个世纪末schmidt rj等使用转座子标签技术克隆了经典突变体o2，o2突变体籽粒醇溶蛋白含量降低，赖氨酸和色氨酸含量显著性升高，这给玉米育种界带来了里程碑的发展。o2也因此成为了遗传学、分子生物学以及细胞生物学等多领域研究非常活跃的基因之一。o2是玉米胚乳发育过程中第一个被报道调控醇溶蛋白表达的核心调控因子，o2突变极大地改良了玉米营养品质。但o2突变体籽粒因产量低、易碎、易感染虫害等不良性状限制了其育种推广。育种学家通过筛选o2修饰因子，试图将o2粉质表型变为硬质，同时保持高赖氨酸性状，这种硬质o2突变体被称为优质蛋白玉米，墨西哥国际玉米小麦改良中心生化学家evangelinavillegas和育种学家surinder vasal因选育优质蛋白玉米获得2000年的世界粮食奖(holding et al.,2008；wu et al.,2010)。

3、chip-seq和rna-seq联合分析发现o2可调控除16-kdaγzein外的所有醇溶蛋白基因表达，o2还可调控有关碳氮代谢以及非生物胁迫相关的因子(li et al.,2015)。此外，o2直接调控淀粉合成途径关键基因ppdk和ssiii影响淀粉的合成(zhang et al.,2016)。o2直接激活蔗糖合酶基因sh1、sus1和sus2影响蔗糖分解代谢途径(deng et al.,2020)。o2调控gras家族转录因子zmgras11促进胚乳细胞扩张(ji et al.,2021)。因此，o2被认为是玉米胚乳灌浆核心调控因子。

4、o2功能极为复杂，不仅表现为调控众多的下游靶基因，其本身还受到众多的翻译后修饰调控。蛋白翻译后修饰可以改变蛋白的构象，影响蛋白分布、蛋白互作、蛋白活性以及稳定性等(dai vu et al.,2018)。前期研究发现o2可被e3泛素连接酶zmrfwd3泛素化，增强o2核定位信号(li et al.,2020)。o2通过zmsnrk1a2-zmrfwd3-o2信号途径响应昼夜节律糖含量变化，改变储藏物质合成。1997年，o2被报道存在磷酸化修饰，等电点实验发现有多个磷酸化条带(pietro ciceri,1997)。昼夜节律影响o2磷酸化水平，黑夜期间o2磷酸化强度高于白天。但在整个籽粒灌浆过程中o2均被磷酸化，o2磷酸化现象虽然报道了二十多年，但其生物学机制以及是否可用于育种改良一直未被深入解析。因此，解析o2磷酸化的生物学功能，将有助于我们定向筛选优良的变异位点，有利于定向改良玉米籽粒产量和品质。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种经磷酸化和去磷酸化修饰的o2突变体过表达材料及其用途。

2、为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种o2突变体，o2突变体为对o2进行磷酸化或去磷酸化修饰，其序列分别如seqid no.1和seq id no.2所示。

4、进一步地，seq id no.1所示的核酸序列编码的蛋白的氨基酸序列如seq idno.3，seq id no.2所示的核酸序列编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。

5、进一步地，磷酸化修饰位点为第41位的丝氨酸；其中，将其突变为天冬氨酸时，获得磷酸化状态的o2突变体；

6、将其突变为丙氨酸时，获得去磷酸化修饰状态的o2突变体。

7、上述经磷酸化修饰处理获得的o2突变体，或o2在提升玉米籽粒粒宽和粒重中的用途。

8、上述o2，或经去磷酸化修饰处理获得的o2突变体在增多玉米籽粒胚乳硬质部分和容重中的用途。

9、上述o2，或经去磷酸化修饰处理获得的o2突变体在增多玉米淀粉和醇溶蛋白中的用途。

10、一种提升玉米籽粒粒宽和粒重的制剂，以促进上述o2或经磷酸化修饰处理获得的o2突变体过表达的成分为活性成分，或以上述o2或经磷酸化修饰处理获得的o2突变体编码的蛋白为活性成分。

11、一种增多玉米籽粒胚乳硬质部分的制剂，以促进上述o2或经去磷酸化修饰处理获得的o2突变体过表达的成分为活性成分，或以上述o2或经去磷酸化修饰处理获得的o2突变体编码的蛋白为活性成分。

12、一种增多玉米淀粉和醇溶蛋白的制剂，以促进上述o2或经去磷酸化修饰处理获得的o2突变体过表达的成分为活性成分，或以上述o2或经去磷酸化修饰处理获得的o2突变体编码的蛋白为活性成分。

13、上述o2、o2突变体在定向培育高产优质玉米以及玉米种质资源改良中的用途。

14、本发明的有益效果：

15、本发明通过液相质谱鉴定发现o2第41位丝氨酸可被磷酸化，转基因创制用o2启动子驱动o2全长cds过表达植株、第41位丝氨酸突变为丙氨酸模拟持续非磷酸化以及突变为天冬氨酸模拟持续磷酸化的植株。考察表型发现o2过表达转基因籽粒粒宽、面积、硬质胚乳面积、百粒重、容重、淀粉和醇溶蛋白含量显著增加。相对于野生型，o2第41位丝氨酸模拟持续磷酸化的突变体籽粒粒长、粒宽、面积、百粒重均增加，但容重、淀粉和醇溶蛋白含量没有很显著变化。相对于野生型，o2第41位丝氨酸模拟持续非磷酸化突变体材料粒长、粒宽、面积均减少，但百粒重、容重、淀粉和醇溶蛋白含量均显著提升。

技术特征：

1.一种o2突变体，其特征在于，所述o2突变体为对o2进行磷酸化或去磷酸化修饰，其序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。

2.根据权利要求1所述的o2突变体，其特征在于，seq id no.1所示的核酸序列编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.3，seq id no.2所示的核酸序列编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。

3.根据权利要求1所述的经磷酸化和去磷酸化修饰的o2过表达材料，其特征在于，磷酸化修饰位点为第41位的丝氨酸；其中，将其突变为天冬氨酸时，获得磷酸化状态的o2突变体；

4.权利要求1中所述的经磷酸化修饰处理获得的o2突变体，或o2在提升玉米籽粒粒宽和粒重中的用途。

5.权利要求1中所述的o2，或经去磷酸化修饰处理获得的o2突变体在增多玉米籽粒胚乳硬质部分和容重中的用途。

6.权利要求1中所述的o2，或经去磷酸化修饰处理获得的o2突变体在增多玉米淀粉和醇溶蛋白中的用途。

7.一种提升玉米籽粒粒宽和粒重的制剂，其特征在于，以促进权利要求1中所述的o2或经磷酸化修饰处理获得的o2突变体过表达的成分为活性成分，或以权利要求1中所述的o2或经磷酸化修饰处理获得的o2突变体编码的蛋白为活性成分。

8.一种增多玉米籽粒胚乳硬质部分的制剂，其特征在于，以促进权利要求1中所述的o2或经去磷酸化修饰处理获得的o2突变体过表达的成分为活性成分，或以权利要求1中所述的o2或经去磷酸化修饰处理获得的o2突变体编码的蛋白为活性成分。

9.一种增多玉米淀粉和醇溶蛋白的制剂，其特征在于，以促进权利要求1中所述的o2或经去磷酸化修饰处理获得o2突变体过表达的成分为活性成分，或以权利要求1中所述的o2或经去磷酸化修饰处理获得的o2突变体编码的蛋白为活性成分。

10.权利要求1中所述的o2、o2突变体在定向培育高产优质玉米以及玉米种质资源改良中的用途。

技术总结
本发明公开了一种经磷酸化和去磷酸化修饰获得的o2突变体及其用途，属于生物工程技术领域。该经磷酸化和去磷酸化修饰的O2过表达材料的核酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明通过液相质谱鉴定发现O2第41位丝氨酸可被磷酸化，转基因创制用O2启动子驱动O2全长CDS过表达植株、第41位丝氨酸突变为丙氨酸模拟持续非磷酸化以及突变为天冬氨酸模拟持续磷酸化的植株，发现O2模拟持续磷酸化的转基因籽粒粒长、粒宽、面积、百粒重均增加。O2模拟持续非磷酸化的转基因材料百粒重、容重、淀粉和醇溶蛋白含量均显著提升。

技术研发人员：杨桃,黄云钦,廖龙雨
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/1