一种基于RNaseHⅡ酶依赖-锁核酸-阻滞探针-环介导恒温扩增的单核苷酸多态性等温分型方法

本发明属于分子生物学，涉及单核苷酸多态性的等温检测与分型，具体涉及基于rnase hⅱ酶依赖-锁核酸-阻滞探针-环介导恒温扩增荧光技术(lamp-lna-blocker-rnase hⅱ-eve green,lamp-lbr-eve)的单核苷酸多态性基因分型检测体系的方法。

背景技术：

1、耳聋是由遗传或环境因素引起，其中遗传因素占50％。按其遗传方式可分为常染色体显性遗传、常染色体隐形遗传、x连锁遗传和线粒体遗传等。在遗传致聋因素中，线粒体dna(mitochondrion dna,mt dna)突变与药物性耳聋及非综合征型耳聋的发病密切相关。国内外大量、系统的研究表明：线粒体dna 1555a>g和1494c>t突变为母系遗传药物性耳聋发生的遗传基础，氨基糖甙类抗生素是其致聋的主要诱因。

2、线粒体是存在于大多数真核细胞中的一类具有双层膜结构的半自主细胞器，拥有独立的遗传物质即mt dna。mt dna突变在全世界不同地区存在差异，1555a>g突变，在普通人群的发生率为0.08％～0.7％，耳聋人群中的发生率为0.42％～17％，而1494c>t突变则分别为0.01％～0.25％和0.18％～0.7％。1555a>g和1494c>t的突变，改变了线粒体12srrna高度保守区域结构，使得其转录后的rrna结构与细菌16s rrna结构相似，从而易于与氨基糖甙类抗生素结合。氨基糖甙类抗生素，如链霉素、庆大霉素等，能够与突变后的线粒体12s rrna相结合，使得线粒体核糖体空间构象发生变化，影响线粒体蛋白质的翻译，进而使得线粒体氧化磷酸化功能障碍，atp产生不足，影响内耳内、外毛细胞的能量产生及利用，造成毛细胞的损伤，且毛细胞的损伤是不可逆的，两者共同导致耳聋的发生。

3、目前耳聋基因遗传学检测技术包括下一代测序技术、多重连接探针扩增技术、变性高效液相色谱、微阵列基因芯片检测技术、实时荧光检测技术、片段分析技术、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、高分辨率熔解曲线分析技术、sanger测序等。但相关技术存在检测环境要求高、实验操作复杂、设备相对昂贵、时间长等缺点，难以在基层医院和社区诊所普及。

4、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,lamp)在恒温条件下，能快速、高效、特异地扩增dna。该技术的原理是针对靶基因的6～8个特定区域设计6～8种引物，利用一种链置活性的dna聚合酶在恒温条件下催化新链的合成，在短时间内可以实现核酸扩增。lamp可以在15～60min内扩增出109靶序列拷贝。lamp引物的设计是该技术的核心。lamp引物设计主要靶定在靶序列上的6个序列区间，分别标记为f3c、f2c、f1c、b1、b2和b3，根据这6个区间共设计4条引物fip、bip、f3、b3。正向内引物fip由f1c序列和f2序列组成，反向内引物bip由b1c序列和b2序列组成，f3为正向外引物(与f3c序列互补)，b3为反向外引物(与b3c序列互补)。fip、bip、f3、b3引物为必需引物，为了提高lamp反应速度，常在反应体系中添加两条环引物，即lf引物与lb引物。内引物与靶基因的响应区域杂交结合后，在bst聚合酶的作用下开始链的合成，由此触发lamp反应。接下来，外引物f3/b3分别与f3c和b3c结合，各自合成出一条单链进而置换出内引物合成的两条单链。由于这两条链的5'端各自有互补的区域，因此各自会形成一个环状结构。随后在另一条外引物的作用下，另一端也形成一个环状结构，由此形成了lamp反应的初始哑铃结构。以自身结构为模板，3'端的f1区域作为起点，内引物的f1c区域与哑铃结构的f1区域结合，f2区域和f2c区域结合，由此触发循环链置换放大扩增反应；同样bip与哑铃结构的另一端茎环结构的b2c区域互补，启动下一轮放大扩增。由此周而复始，至lamp反应结束，扩增体系里产生了大量由相同特异性序列的反向重复片段组成的dna片段混合物。但lamp容易形成气溶胶，加上bst聚合酶缺乏保真性，特异性低，且反应体系中存在多对引物，容易产生假阳性。

5、锁核酸(locked nucleic acid,lna)是一种含有桥接双环糖基的合成核酸类似物。在2'-o-和4'-位之间添加的亚甲基基团将呋喃核糖“锁定”为3'-内构象。lna:dna杂交体与其对应的dna:dna相比，其退火温度会大幅度升高。dna引物中每掺入一个lna核苷酸可使tm值增加3～8℃。掺入lna核苷酸后，由于lna在错配位点形成watson-crick碱基对的倾向更强，导致探针通过单核苷酸多态性区分等位基因的能力大大增强。

6、blocker探针为人工合成的一段单链核苷酸序列，blocker探针与引物最大的区别在于其3′-oh端以3′-spacer c3或3′-phosphat进行修饰。由于其3′-oh被封闭，因此，其不能参与pcr的延伸反应。在pcr退火阶段，野生型blocker序列与野生型模板完全互补配对，阻碍突变型pcr引物与野生型模板结合；而突变型blocker序列与突变型模板配对，阻碍野生型引物与突变型模板结合。由于lna的作用，lna-blocker将优先与模板结合，从而增加检测体系的特异性。

7、rnase hⅱ是一种来源于极端耐热菌株的内源性核酸内切酶，它识别rna/dna杂交链并切割rna链，其对单链rna切割活性极低，且对dsdna、ssdna无切割活性。因此只有当互补靶dna碱基存在时，rnase hⅱ才能消化dna-rna杂交链，使dna-rna杂交链在rna碱基的5′侧发生裂解，留下具有3′-oh的dna寡核苷酸，该3′-oh dna寡核苷酸能够起到引物的作用，从而允许引物延伸。由于仅在与互补靶序列紧密结合时才发生rna化引物的裂解切割，故极大地提高了反应的准确性。rnase hⅱ的应用需要配合专一的特殊引物。该引物含有一个rna残基和一个3′端封闭部分。在引物与目标dna杂交后，rna碱基的5′端，被rnase hⅱ酶识别并切割，得到的3′-oh，从而获得延伸的能力。

技术实现思路

1、本技术提供了一种恒温条件下的单基因多态性基因分型技术。该技术利用rnasehⅱ酶特异性水解dna-rna杂合链中的rna，但不水解单链或双链dna或rna中的磷酸二酯键，即不消化单链或双链dna或rna的特点，分别设计针对野生型和突变型的rna/dna杂合型引物，辅以对应的锁核酸-阻滞探针，在引物和探针双重作用下提高对单碱基识别和扩增能力，确保体系的保真性。只有在无阻滞探针结合的情况下、rna/dna杂合引物在与目标dna碱基序列互补时，引物的rna一侧才能被rnase hⅱ降解，从而获得延伸能力，在链置环活性bst-taq聚合酶作用下催化新链合成，同时而环引物的延伸能够显著提高lamp的扩增效率，短时间内实现核酸大量扩增，通过检测荧光信号对实时扩增进行监测。据此建立基于rnasehⅱ酶依赖-锁核酸-阻滞探针-环介导恒温扩增荧光技术的耳聋基因1555a>g基因分型检测体系，能在确保特异性的前提下，短时间内实现1555a>g的基因分型。

2、本发明的技术内容如下：

3、第一方面，本发明提供了一种基于恒温扩增的检测药物性耳聋基因1555a>g突变的引物组合物。包含内引物、外引物以及环引物，即f3c、f2c、f1c、b1、b2和b3以及lf和lb。其中f1c和f2组成fip，b1c和b2组成bip。

4、本发明中所涉及的blocker探针为人工合成的一段单链核苷酸序列，长度为15～40个碱基，其3′-oh端以3′-spacer c3或3′-phosphat进行修饰。在pcr退火阶段，野生型blocker探针与野生型模板完全互补配对，阻碍突变型pcr引物与野生型模板结合，而突变型blocker探针与突变型模板配对，阻碍野生型引物与突变型模板结合。

5、本发明中所涉及的blocker探针的碱基被锁核酸lna修饰，每2～4个碱基修饰一个lna。

6、本发明所涉及的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括第一引物组和第二引物组，两个引物组都包括5条共同引物和两条基因特异性引物；所述第一引物探针组包括外引物f3、外引物b3、环引物lf、环引物lb、fip引物以及一条1555a的下游等位基因特异性bip引物和一条1555g下游等位基因特异性blocker探针；所述第二引物探针组包括外引物f3、外引物b3、环引物lf、环引物lb、fip引物以及一条1555g的下游等位基因特异性bip引物和一条1555a下游等位基因特异性blocker探针。其中bip引物中，存在rna修饰碱基，其中rna碱基上游有至少3～15个碱基，在该rna碱基下游有3～10个碱基。

7、第二方面，本发明提供了一种检测药物性耳聋基因1555a>g的体系，所述体系包括第一方面所述的引物探针组合物。

8、本发明所涉及的反应体系中包括lamp引物、rna修饰的bip引物、lna修饰的blocker探针、dntp、缓冲液bst聚合酶、rnase hii、石蜡油、甜菜碱和ddh2o等。

9、本发明中所涉及的dna聚合酶bst taq是既不具有5'→3'外切酶活性，也不具有3'→5'的外切酶活性，能够满足引物与模板结合并延伸、扩增的工作条件即可。

10、本发明中所涉及的rnase hⅱ是一种来源于极端耐热菌株的内源性核酸内切酶，它识别rna/dna杂交链并切割rna链，其对单链rna切割活性极低，且对dsdna、ssdna无切割活性，浓度为5u/μl，使用体积0.01μl～1.0μl。

11、本发明中所涉及的反应体系中，使用eve-green作为荧光染料。

12、在本发明中，对snp进行分型，需要设置两组反应体系，对同一个样本进行扩增。分别设计针对野生型和突变型的rna/dna杂合型引物，辅以对应的锁核酸-阻滞探针，在引物和探针双重作用下提高对单碱基识别和扩增能力，确保体系的保真性。只有在无阻滞探针结合的情况下、rna/dna杂合引物在与目标dna碱基序列互补时，引物的rna一侧才能被rnase hⅱ降解，从而获得延伸能力，在链置环活性bst-taq聚合酶作用下催化新链合成，同时环引物的延伸能够显著提高lamp的扩增效率，短时间内实现核酸大量扩增，通过检测荧光信号对实时扩增进行监测。以相应的野生型质粒、突变型质粒dna样本为模板，进行lamp-lbr-eve检测。反应体系如表1所示。

13、表1lamp-lbr-eve反应体系

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16、本发明对snp进行分型的过程中，代表snp对应核苷酸类型的引物分别对相同的待测模板进行扩增。扩增反应与探针的杂交不需要分管进行，可以实现一步检测。整个lamp反应的温度一般在60℃至63℃，较高的反应温度有利于筛选tm值合适的短链探针，从而降低非互补的探针产生的背景。

17、本发明所述snp等温分型方法在引物设计、扩增反应体系、反应条件和仪器设备方面可依循普通环介导等温扩增。

18、第三方面，本发明提供了一种检测药物性耳聋基因1555a>g的方法，

19、采用如第一方面所述的引物探针组合、如第二方面所述的体系对样本dna进行荧光定量pcr，根据扩增曲线的有无对药物性耳聋基因1555a>g进行分型。

20、所述lamp-lbr-eve扩增过程为：

21、①将pcr八联管放入荧光pcr仪样本槽。

22、②荧光检测通道选择：fam(reporter:fam，quencher:none)。

23、③pcr程序参数按照表2进行设定：

24、表2lamp-lbr-eve扩增程序

25、

26、④数据分析。

27、所述药物性耳聋基因1555a>g分型的依据为：

28、仅1555a检测体系中扩增曲线依次经过荧光背景期、指数扩增期、平台期三个阶段，呈现经典的s形曲线，判断样本为野生型(1555a)。

29、仅1555g检测体系中扩增曲线依次经过荧光背景期、指数扩增期、平台期三个阶段，呈现经典的s形曲线，判断样本存在1555a>g突变，为突变型(1555g)。

30、1555a检测体系和1555g检测体系中扩增曲线依次经过荧光背景期、指数扩增期、平台期三个阶段，均呈现经典的s形曲线，判断样本存在1555a>g突变，为杂合型(1555a/g)。

31、本发明基于rnase hⅱ酶特异性地水解dna-rna杂合链中的rna，但不水解单链或双链dna或rna中的磷酸二酯键，即不消化单链或双链dna或rna的特点，分别设计针对野生型和突变型的rna/dna杂合型引物，在体系中增加对应的锁核酸-阻滞探针，在引物和探针双重作用下提高对单碱基的识别和扩增能力，确保体系的保真性。只有在未有阻滞探针结合的情况下，且rna/dna杂合引物与目标dna碱基序列互补时，引物的rna一侧才能被rnasehⅱ降解，从而获得延伸的能力。然后在链置换活性bst-taq聚合酶的作用下催化新链的合成，在20分钟内实现核酸的大量扩增，通过荧光采集进行实时扩增监测。

32、第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的引物组合物、如第二方面所述的检测体系在药物性耳聋诊断中的应用。

33、(1)本发明设计5条共同引物和两条基因特异性引物，基于rnase hⅱ酶依赖-锁核酸-阻滞探针-环介导恒温扩增荧光技术，实现了对线粒体dna 12s rrna 1555a>g基因分型检测。

34、(2)本发明将rnase hⅱ酶和rna/dna引物的特异性和lamp高效扩增的特点进行结合，在实时荧光定量pcr平台上实现对样本基因多态性的检测，其检测过程简单快捷，仅需20分钟即可完成所有检测；且在操作过程中可有效避免接触eb染料等强致癌物，减少了对操作人员的危害。

35、(3)本发明同时利用锁核酸-阻滞探针可增加检测特异性：锁核酸的存在使得锁核酸-阻滞探针的tm值高于其它引物，探针可优先和互补的模板进行结合，起到屏蔽模板的作用。野生型blocker序列与野生型模板完全互补配对，阻碍了突变型pcr引物进一步与野生型模板结合，而突变型blocker序列与突变型模板配对，阻碍野生型引物与突变型模板结合。由于lna的作用，lna-blocker将优先于对应的模板结合，从而增加检测体系的特异性。

36、(4)本发明的检测方法具有较好的特异性、灵敏度和重复性，可以作为耳聋基因临床检测的可选方法。

37、如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。

38、“dna”：脱氧核糖核酸。是一类带有遗传信息的生物大分子，由4种主要的脱氧核糖核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成，是遗传信息的载体。

39、“单核苷酸多态性”：全称single nucleotide polymorphism，简称snp，是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。从理论上来看，根据核苷酸种类的不同，每一个snp位点都可以有4种不同的变异形式，主要包括转换(c→t)和颠换(c→a，g→t，c→g，a→t)。

40、“lamp”：环介导的等温扩增。是一种体外等温扩增dna特意片段的技术，扩增过程分为初始产物形成阶段以及循环扩增阶段，最终产生具有大量反向重复序列的dna大分子片段，该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

41、“环引物”：lamp反应中引入的针对于其中间产物单链环上区别于内引物区的特异性引物，可以显著的增强lamp反应的效率。

42、“锁核酸”：全称locked nucleic acid，简称lna，是一种含有桥接双环糖基的合成核酸类似物。

43、“tm值”：dna双链的熔解温度。双链dna解链至一半时的温度，主要受到dna链中碱基数量以及碱基组成的影响。