一种将毛乳头细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法与流程

本发明属于细胞重编程，具体涉及一种将毛乳头细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法。

背景技术：

1、ipsc诱导性多能干细胞全称为induced pluripotent stem cells，是通过人工诱导非多能性细胞表达某种特定基因得到的。ipscs和天然多功能干细胞在很多方面具有相似性，比如某种干细胞基因和蛋白的表达，染色质甲基化模式，倍增之间，胚体形成，畸胎瘤形成，不同嵌合体的形成，以及分化潜能。

2、诱导性多能干细胞与干细胞的最大区别就在于，他并非是直接来源于人体器官和组织，而是一种通过基因编辑而来的干细胞。例如首次发现它的山中伸弥，便是利用病毒载体将四个转录因子(oct4,sox2,klf4和c-myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的诱导性多能干细胞。而世界各地不同研究者陆续发现其它方法同样也可以制造这种细胞，只需要根据其类型，选择相应的制备方式。

3、小环载体(minicircle vectors)最初是作为附加型载体的较小替代体而开发的，其具有更高的转染效率。它们是环状的非病毒dna元件，它们包含目标序列即oct3/4，sox2，nanog，lin28等。微环编码基因不易被靶向的细胞和外来核酸灭活和沉默，其在分裂和非分裂细胞中均高效表达，因此可以产生高表达水平的目的蛋白。因此在ipsc细胞重编程过程中是一个良好的选择。

4、目前，ipsc细胞重编程的相关研究仍较少。

5、因此，需要提供一种针对上述现有技术不足的改进技术方案。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种将毛乳头细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，以解决或改善上述技术问题。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种将毛乳头细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，包括下述步骤：(1)向毛乳头细胞的细胞悬浮液中加入4合1comip质粒，混合，转移到电转杯中，加入电转试剂，置于电转仪中进行电转；(2)将经步骤(1)电转处理后得到的细胞接种于培养容器中，采用第一培养基进行培养；(3)将培养基依次更换为第二培养基、第三培养基和第四培养基，继续培养；(4)挑取单克隆细胞接种到新的培养容器中，采用第五培养基进行培养；(5)将第五培养基更换为第六培养基，即得诱导性多能干细胞；所述第一培养基为dp完全培养基；所述第二培养基为含有丁酸钠和抗坏血酸的dp完全培养基；所述第三培养基为所述第二培养基与mtesr-e7培养基的混合物；所述第四培养基为含有丁酸钠和抗坏血酸的mtesr-e7培养基；所述第五培养基为含有rock抑制剂的e8培养基；所述第六培养基为e8培养基。

3、优选地，所述第一培养基、第二培养基和第三培养基培养的时间为2d；所述第四培养基培养至有明显克隆出现，培养的时间为20-30d，培养过程中每两天换液一次；所述第五培养基用于细胞传代或复苏的当天。

4、优选地，所述第三培养基中，第二培养基与mtesr-e7培养基的质量比为1:1；所述第五培养基中rock抑制剂的浓度10μm；所述第二培养基和/或第四培养基中，丁酸钠的浓度为0.2mm，抗坏血酸的浓度为50μg/ml。

5、优选地，步骤(1)中，所述细胞悬浮液中的毛乳头细胞的密度为1000万/毫升，所述4合1comip质粒的用量比例12μg/100μl细胞悬浮液。

6、优选地，步骤(2)中，所述接种的密度为(0.5-2)×105细胞/孔(六孔板)。

7、优选地，步骤(2)中，所述培养容器为matrigel或cellstart预包被的培养板。

8、优选地，所述rock抑制剂为y-27632。

9、有益效果：

10、本发明的将毛乳头细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法采用来源于毛囊的毛乳头细胞作为细胞来源，分离工艺简单，对机体无伤害，获得量大，可迅速扩增。

11、本发明的将毛乳头细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法的转染工艺简单，使用小环载体，只要转染一个载体，转染一次即可获得足够量的诱导性多能干细胞。采用本发明的方法重编程得到的诱导性多能干细胞经鉴定符合诱导性多能干细胞的要求。

技术特征：

1.一种将毛乳头细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括下述步骤：

2.如权利要求1所述的将毛乳头细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，所述第一培养基、第二培养基和第三培养基培养的时间为2d；

3.如权利要求1所述的将毛乳头细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述第三培养基中，第二培养基与mtesr-e7培养基的质量比为1:1；

4.如权利要求1所述的将毛乳头细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞悬浮液中的毛乳头细胞的密度为1000万/毫升，所述4合1comip质粒的用量比例12μg/100μl细胞悬浮液。

5.如权利要求1所述的将毛乳头细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述接种的密度为(0.5-2)×105细胞/孔。

6.如权利要求1所述的将毛乳头细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养容器为matrigel或cellstart预包被的培养板。

7.如权利要求1所述的将毛乳头细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述rock抑制剂为y-27632。

技术总结
本发明属于细胞重编程技术领域，具体涉及一种将毛乳头细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法。本发明的将毛乳头细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，包括下述步骤：(1)向毛乳头细胞的细胞悬浮液中加入4合1CoMiP质粒，混合，电转；(2)将经步骤(1)电转处理后得到的细胞接种于培养容器中，采用第一培养基进行培养；(3)将培养基依次更换为第二培养基、第三培养基和第四培养基，继续培养；(4)挑取单克隆细胞，采用第五培养基进行培养；(5)将第五培养基更换为第六培养基，即得诱导性多能干细胞。采用本发明的方法重编程得到的诱导性多能干细胞经鉴定符合诱导性多能干细胞的要求。

技术研发人员：黄莹之,方攀峰,张俊克
受保护的技术使用者：宁波希诺赛生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29