一种检测牛腹泻相关病毒的多联实时荧光定量试剂盒

本发明涉及生物技术检测领域，更具体地，涉及一种检测牛腹泻相关病毒的多联实时荧光定量试剂盒。

背景技术：

1、犊牛腹泻是影响世界养牛业发展的重要疾病。引起犊牛腹泻的病原包括寄生虫、细菌和病毒。

2、环曲病毒(torovirus，tov)为套式病毒目(nidovirales)托巴套氏病毒科(tobaniviridae)环曲病毒亚科(torovirinae)环曲病毒属(torovirus)单股正链rna病毒，作为消化道的病原，目前已经在牛、猪、马、山羊和人等多个物种检测到该病毒。牛环曲病毒(bovine torovirus，btov)1982年在美国的一次爆发性腹泻中首次发现，有研究表明在腹泻的犊牛中存在广泛感染，尤其是小于三周龄的犊牛更易感。目前在对btov的检测中，全球有17个国家检出阳性，其危害所带来的影响受到越来越多的关注。

3、牛肠道病毒(bovine enterovirus，bev)为肠道病毒属的无囊膜单股正链rna病毒。最初该病毒被认为是无致病性的，但目前的研究表明，感染牛虽大多数处于亚临床症状，但也分离到多种引起严重临床症状的毒株，临床症状包括腹泻、血便、呼吸道症状、产奶量减少和生殖障碍，造成严重的经济损失。

4、牛诺如病毒(bovine norovirus，bnov)属于杯状病毒科诺如病毒属，为无囊膜的单股正链rna病毒。诺如病毒是引起腹泻的重要病原，可导致多个物种引起严重腹泻，如猪、牛、羊、犬、猫、鼠和人。1976年，英国首次报道了牛诺如病毒，随后在美国、德国、意大利、韩国、中国等世界多个国家均有报道。有回归试验证实牛诺如病毒感染后会引起严重的腹泻症状以及明显的肠道病变。该病毒主要引起犊牛腹泻，在成母牛、青年牛以及无症状犊牛的粪便中均可检测到bnov。

5、牛冠状病毒(bovine coronavirus，bcov)属于套氏病毒目(nidoviraes)、冠状病毒科(coronaviridae)、β冠状病毒属，是一种单股正链rna病毒。可引起新生犊牛腹泻、成年牛冬痢疾以及呼吸道疾病。牛冠状病毒于1973年首次被发现并分离，之后在全球范围内检测出该病毒。

6、牛轮状病毒(bovine rotavirus，brv)是呼肠孤病毒科，轮状病毒属的成员，轮状病毒包含7个不同的群(a-g)。犊牛的腹泻主要是由a群轮状病毒引起，以7日龄以内的犊牛最易感，主要影响15～45日龄犊牛，引起犊牛腹泻、脱水、精神沉郁等症状。造成较高的感染率和死亡率。

7、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，bvdv)是属于黄病毒科瘟病毒属的单股正链有囊膜的rna病毒。是影响养牛业发展的重要传染病之一，造成牛免疫障碍并引发出血性感染，引起严重的消化道粘膜糜烂坏死、胃肠炎、腹泻等症状。妊娠母牛感染bvdv可导致繁殖障碍，包括产奶量下降，流产、胎儿生长缓慢及胎儿畸形等。所有年龄段的牛均可感染bvdv，但以犊牛最易感。bvdv于1946年在美国首次发现并分离，往后在世界多个国家均有报道。

8、目前为止国内还没有针对btov、bev、bnov、bcov、brv的商品化疫苗，对于该病的防控较为艰难，主要通过生物安全防控措施进行防控，对牛群进行监测，淘汰带毒牛，实现对牛群的净化。针对bvdv国内虽然有商品化疫苗，但是大部分牛场还是选择淘汰带毒牛、净化牛群的方式进行防控。因此需要一个能够快速检测这六种病原且灵敏的方法来对牛群进行监测。但目前未有使用多联实时荧光定量pcr同时对btov、bev、bnov、bcov、brv和bvdv进行检测的试剂盒和检测方法的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种检测六种牛病毒的多联实时荧光定量pcr引物、探针和试剂盒。

2、本发明的第一个目的是提供一个检测牛腹泻相关病毒的引物组合物

3、本发明的第二个目的是提供一个检测牛腹泻相关病毒的探针组合物。

4、本发明的第三个目的是提供检测牛腹泻相关病毒的多联实时荧光定量pcr检测体系。

5、本发明的第四个目的是提供一种检测牛腹泻相关病毒的多联实时荧光定量pcr试剂盒

6、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

7、一个检测牛腹泻相关病毒的引物组合物，所述引物组合物含有引物组1和引物组2，

8、引物组1含有核苷酸序列如seq id no：1、seq id no：2、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：7和seq id no：8所示的引物；

9、引物组2含有核苷酸序列如seq id no：10、seq id no：11、seq id no：13、seq idno：14、seq id no：16和seq id no：17所示的引物；

10、所述牛腹泻相关病毒为牛环曲病毒、牛肠道病毒、牛诺如病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒中的一种或几种。

11、一个检测牛腹泻相关病毒的探针组合物，所述探针组合物含有探针组1和探针组2，探针组1的核苷酸序列如seq id no：3、seq id no：6和seq id no：9所示，探针组2的核苷酸序列如seq id no：12、seq id no：15和seq id no：18所示，所述牛腹泻相关病毒为牛环曲病毒、牛肠道病毒、牛诺如病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒中的一种或几种。

12、优选地，所述探针组1中各探针3’端均设置有mgb，探针组1中各探针5’端标记的荧光基团不同。

13、更优选地，所述探针组1中各探针5’端标记的荧光基团分别为cy5、vic和fam。

14、优选地，所述探针组1中各探针3’端均设置有mgb，5’端标记的荧光基团不同。

15、更优选地，所述探针组2中各探针5’端标记的荧光基团分别为cy5、vic和fam。

16、所述引物组合物和/或探针组合物在制备检测牛腹泻相关病毒的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内，所述牛腹泻相关病毒为牛环曲病毒、牛肠道病毒、牛诺如病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒中的一种或几种。

17、检测牛腹泻相关病毒的多联实时荧光定量pcr检测体系，所述多联实时荧光定量pcr检测体系包括反应体系1和反应体系2，所述反应体系1中包含所述引物组1，反应体系2中包含引物组2。

18、优选地，所述反应体系1中还包含所述探针组1。

19、更优选地，所述反应体系1中单次反应包含所述引物组1 1.2～4.8μl、所述探针组1 0.3～1.2μl、待检反应模板2μl、2×qpcr probe master mix 10μl和去离子水2～6.5μl。

20、最优选地，所述反应体系1中单次反应包含所述引物组1 2.8μl、所述探针组1 1μl、待检反应模板2μl、2×qpcr probe master mix 10μl和去离子水4.2μl。

21、进一步最优选地，所述反应体系1中单次反应包含

22、苷酸序列为seq no.1的btov-f：0.4μl(10μm)；

23、核苷酸序列为seq no.2的btov-r：0.4μl(10μm)；

24、核苷酸序列为seq no.3的btov-mgb：0.4μl(10μm)；

25、核苷酸序列为seq no.4的bev-f：0.5μl(10μm)；

26、核苷酸序列为seq no.5的bev-f：0.5μl(10μm)；

27、核苷酸序列为seq no.6的bev-mgb：0.3μl(10μm)；

28、核苷酸序列为seq no.7的bnov-f：0.5μl(10μm)；

29、核苷酸序列为seq no.8的bnov-r：0.5μl(10μm)；

30、核苷酸序列为seq no.9的bnov-mgb：0.3μl(10μm)；

31、待检反应模板2μl、2×qpcr probe master mix 10μl和去离子水4.2μl。

32、优选地，所述反应体系2中还包含所述探针组2。

33、更优选地，所述反应体系2中单次反应包含所述引物组2 1.2～4.8μl、所述探针组2 0.3～1.2μl、待检反应模板2μl、2×qpcr probe master mix 10μl和去离子水2～6.5μl。

34、最优选地，所述反应体系2中单次反应包含所述引物组2 2.6μl、所述探针组2 0.8μl、待检反应模板2μl、2×qpcr probe master mix 10μl和去离子水4.6μl。

35、进一步最优选地，所述反应体系2中单次反应包含

36、核苷酸序列为seq no.10的bcov-f：0.3μl(10μm)；

37、核苷酸序列为seq no.11的bcov-r：0.3μl(10μm)；

38、核苷酸序列为seq no.12的bcov-mgb：0.3μl(10μm)；

39、核苷酸序列为seq no.13的brv-f：0.4μl(10μm)；

40、核苷酸序列为seq no.14的brv-f：0.4μl(10μm)；

41、核苷酸序列为seq no.15的brv-mgb：0.3μl(10μm)；

42、核苷酸序列为seq no.16的bvdv-f：0.6μl(10μm)；

43、核苷酸序列为seq no.17的bvdv-r：0.6μl(10μm)；

44、核苷酸序列为seq no.18的bvdv-mgb：0.2μl(10μm)、

45、待检反应模板2μl、2×qpcr probe master mix 10μl和去离子水4.6μl。

46、所述多联实时荧光定量pcr检测体系在制备检测牛腹泻相关病毒的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内，所述牛腹泻相关病毒为牛环曲病毒、牛肠道病毒、牛诺如病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒中的一种或几种。

47、一种检测牛腹泻相关病毒的多联实时荧光定量pcr试剂盒，所述牛腹泻相关病毒为牛环曲病毒、牛肠道病毒、牛诺如病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒中的一种或几种，

48、所述多联实时荧光定量pcr试剂盒包括：

49、组分a：所述引物组合物中的引物组1；

50、组分b：所述引物组合物中的引物组2。

51、优选地，所述组分a还含有所述探针组合物中的探针组1。

52、更优选地，组分a单次反应用量组成如下：

53、核苷酸序列为seq no.1的btov-f：0.4μl(10μm)；

54、核苷酸序列为seq no.2的btov-r：0.4μl(10μm)；

55、核苷酸序列为seq no.3的btov-mgb：0.4μl(10μm)；

56、核苷酸序列为seq no.4的bev-f：0.5μl(10μm)；

57、核苷酸序列为seq no.5的bev-f：0.5μl(10μm)；

58、核苷酸序列为seq no.6的bev-mgb：0.3μl(10μm)；

59、核苷酸序列为seq no.7的bnov-f：0.5μl(10μm)；

60、核苷酸序列为seq no.8的bnov-r：0.5μl(10μm)；

61、核苷酸序列为seq no.9的bnov-mgb：0.3μl(10μm)，共3.8μl。

62、优选地，所述组分b还含有所述探针组合物中的探针组2。

63、更优选地，组分b单次反应用量组成如下：

64、核苷酸序列为seq no.10的bcov-f：0.3μl(10μm)；

65、核苷酸序列为seq no.11的bcov-r：0.3μl(10μm)；

66、核苷酸序列为seq no.12的bcov-mgb：0.3μl(10μm)；

67、核苷酸序列为seq no.13的brv-f：0.4μl(10μm)；

68、核苷酸序列为seq no.14的brv-f：0.4μl(10μm)；

69、核苷酸序列为seq no.15的brv-mgb：0.3μl(10μm)；

70、核苷酸序列为seq no.16的bvdv-f：0.6μl(10μm)；

71、核苷酸序列为seq no.17的bvdv-r：0.6μl(10μm)；

72、核苷酸序列为seq no.18的bvdv-mgb：0.2μl(10μm)，共3.4μl。

73、优选地，所述多联实时荧光定量pcr试剂盒还含有

74、组分c：荧光定量pcr试剂；

75、组分d：阳性对照品1：三个连接有牛环曲病毒m基因、牛肠道病毒5'utr基因和牛诺如病毒rdrp基因的重组阳性质粒dna；

76、组分e：阳性对照品2：三个连接有牛冠状病毒n基因、牛轮状病毒nsp5基因和牛病毒性腹泻病毒5'utr基因的重组阳性质粒dna。

77、更优选地，所述组分c为2×qpcr probe master mix。

78、进一步更优选地，所述多联实时荧光定量pcr试剂盒还含有组分f：去离子水。

79、所述多联实时荧光定量pcr试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，具体步骤为：

80、s1.提取腹泻犊牛粪便或肛拭子样本rna，再反转录为cdna；

81、s2.以步骤s1制备得到的cdna作为待检反应模板，使用所述的多联实时荧光定量pcr试剂盒配制反应体系；

82、s3.使用步骤s3配制得到的反应体系进行实时荧光定量pcr扩增，所述扩增程序为：95℃5min；95℃10s；57～62℃30s，45个循环，在60℃进行荧光信号采集；

83、s4.根据步骤s3的扩增反应循环数进行结果判定：将反应循环数在35个以内并且扩增曲线良好的反应判断为病毒感染阳性；反应循环数为35～40个，且有扩增曲线的反应判断为可疑，需再次进行反应进行判定；无反应循环数和扩增曲线的判断为病毒感染阴性。

84、优选地，步骤s2中所述反应体系分为反应体系1、反应体系2、阳性对照反应体系1和阳性对照反应体系2；

85、反应体系1中包含组分a3.8μl、待检反应模板2μl、组分c10μl和去离子水4.2μl，合计20μl，为单次反应用量；

86、反应体系2中包含组分b 3.4μl、待检反应模板2μl、组分c10μl和去离子水4.6μl，合计20μl，为单次反应用量；

87、阳性对照反应体系1中包含组分a3.8μl、组分d 2μl、组分c10μl和去离子水4.2μl，合计20μl，为单次反应用量；

88、阳性对照反应体系2中包含组分b 3.4μl、组分e 2μl、组分c10μl和去离子水4.6μl，合计20μl，为单次反应用量。

89、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

90、本发明根据bnov rdrp基因、bev 5'utr基因、btov m基因、bcov n基因、brv nsp5基因、bvdv 5'utr基因的保守区域设计六对特异性引物和六条特异性探针，所述特异性探针为taqman小沟结合物(minor groove binder，mgb)探针，taqman mgb探针是一种双标记探针，5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有非荧光淬灭基团nfq，3'端还包含1个小沟结合物mgb，mgb可以增加探针的退火温度tm值，使探针与模板结合更加稳定。而且taqman mgb探针长度明显短于常规探针，因此可以提高序列鉴别的灵活性，能够适用于更多的检测模板。由于taqman mgb探针通过nfq基团淬灭另一端荧光报告基团所产生的信号，因而本底信号低于其他的常规探针，可以提高检测的灵敏度和精准度。

91、而且，发明人选择btov、bev、bnov、bcov、brv和bvdv序列的保守区域设计引物，探针选择mgb探针进一步提高其特异性，有助于确保检测结果的准确性和可靠性；本发明请求保护的六对特异性引物和六条特异性探针均具有高灵敏度，针对btov、bev、bnov、bcov、brv和bvdv阳性重组质粒的检测极限分别为1.91copies/μl、96.0copies/μl、12.8copies/μl、16.4copies/μl、18.2copies/μl和65.3copies/μl。

92、使用含有本发明请求保护的六对特异性引物和六条特异性探针的试剂盒进行犊牛疾病监测，可以在同一反应程序下使用两个反应体系检测六种病原，操作简便，有效避免多次加样导致污染的情况；而且整个反应程序所需时间不超过1h，用时短；无需进行凝胶电泳，只需观察ct值和扩增曲线即可判断，结果判定简便。

93、由此可知，本发明请求保护的引物、探针特异性高、灵敏度好；本发明请求保护的试剂盒操作简便、用时短、结果判定简便、可同时快速检测btov、bev、bnov、bcov、brv和bvdv，在犊牛腹泻疫病的临床现地快速检测中具有广阔的应用前景。