一种有效提取过量尿液样本中ctDNA的方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种有效提取过量尿液样本中ctdna的方法。

背景技术：

1、循环肿瘤dna(circulating tumor dna,ctdna)是由肿瘤细胞释放到循环系统如血液中的细胞外肿瘤dna小片段，主要来源于机体中坏死、凋亡的肿瘤细胞，循环肿瘤细胞，以及肿瘤细胞产生的外排体。ctdna最早在癌症患者体液中的循环游离dna(circulatingfree dna,cfdna)中发现，不同于cfdna的长度在160bp左右，ctdna大小通常在100bp以下甚至是50bp以下；ctdna占cfdna的比重极低，早期肿瘤患者或治疗缓解患者ctdna占cfdna的比例约0.01％-1.7％，在中晚期患者中约5％-8％，且一旦进入循环系统，ctdna清除速度很快，半衰期从15分钟至几小时不等，尿液ctdna则通过肾脏和肝脏迅速清除，根据肿瘤类型和发生部位不同，ctdna含量在个体间的差异大。由于ctdna是来源于肿瘤细胞的dna，因此其基因信息和肿瘤具有高度一致性，包括突变，缺少，插入，重排，拷贝数异常及甲基化等肿瘤特异性遗传学特点，ctdna也被视为肿瘤细胞中有特征性的生物标志物。

2、尿液是一种常见的生物性样本，是通过肾脏屏障过滤后收集的体液。血液中少量的cfdna和ctdna可以通过肾脏过滤进入尿液。尿液ctdna由两部分组成，第一种是经肾肿瘤dna(trtdna)，它来源于血浆并通过肾小球过滤进入尿液(通常指非泌尿系统肿瘤)；另一种是来源于直接从泌尿道脱落的肿瘤细胞dna(ucfdna)，由于没有经过肾过滤，其分子量可能更大(通常指泌尿系统肿瘤)。trtdna和ucfdna两种的临床效用均被证明是可行的，并且检测结果与从组织和血浆ctdna测序获得的结果高度一致。尿液trtdna替代血液ctdna检测非泌尿系统肿瘤具有以下优势：(1)尿液样本采集是非侵入性的，是一种真正意义上的无创检测样本；(2)尿液采样样本体积大，可重复多次采样且采样量不限，通过结合核酸富集技术可以解决样本量不足导致的核酸总量低的问题；(3)尿液采集方便，不需要专业人员的操作，是居家检测理想的样本类型；(4)尿液不会受到hiv病毒的感染，可减少样本核酸受其他病原微生物的感染。

3、目前常见的尿液ctdna(trtdna)提取方法主要有二氧化硅吸附柱提取和磁珠捕获链霉亲和素探针两种，前者见于多数核酸提取试剂盒，如：qiaamp circulating nucleicacid kit(qiagen)、urine cell-free circulating dna purification kit(norgen)，然而目前商业化的专门针对尿液ctdna提取试剂盒仍非常少，且二氧化硅吸附柱富集的dna片段大小主要在150bp以上，对100bp以下甚至是50bp以下的ctdna核酸回收率很低；另一方面，磁珠捕获法依赖于生物素标记的捕获探针，探针设计难度较大，且探针特异性来看对于尿液样本中极微量的ctdna捕获能力较差。除此之外，尿液样本提取ctdna还面临天然的挑战：(1)尿液含有尿酸、代谢物质等多种杂质，pcr抑制物含量高；(2)核酸酶含量更高，核酸酶i(dnase i)在尿液中的活性是血浆中的100倍以上；(3)ph范围波动较大；(4)尿液ctdna含量极低，一方面由于复杂的尿液环境，另一方面由于尿液ctdna本身半衰期短；(5)临床尿液采样后需要在1-3小时内分离、提取、检验，否则将会大大增加检测的假阴性率，而这样的时间要求在临床实践中极难达到。尽管高通量测序ngs技术以及数字pcr技术等高灵敏核酸检测技术的出现，使得检测微量的尿液ctdna(trtdna)成为可能，如何高效提取、富集和扩增尿液ctdna仍没有标准化方法。

4、因此，开发一种能稳定、有效地富集并提取大量尿液样本中的ctdna(trtdna)的方法是非常有必要的，为液态无创活检提供高质量的、能动态反映肿瘤变化的ctdna来源。

技术实现思路

1、针对上述存在的技术问题至少之一，本发明目的是提供一种有效提取过量尿液样本中ctdna的方法。

2、本发明的技术方案是：

3、本发明的一个目的在于提供一种有效提取过量尿液样本中ctdna的方法，包括以下步骤：

4、1)离子交换色谱富集尿液样本ctdna：

5、尿液样本离心取上清液以去除基因组dna，向上清液中加入阴离子交换树脂，充分混匀后离心得到沉淀的树脂；

6、用低盐-乙酸钠缓冲液一重新悬浮树脂，并转移至干净的离心管中，反复清洗树脂三次，离心弃上清液，得到尿液样本富集后的核酸；此步骤可将树脂吸附的核酸置换至盐缓冲液中，优势是能上过量尿液体积；

7、2)二氧化硅吸附柱纯化ctdna：

8、向步骤1)中清洗完毕的树脂中加入高盐-乙酸钠缓冲液二重新悬浮树脂并离心，将得到的上清液转移至另一干净的离心管中，并向其中加入无水乙醇，用于沉淀核酸分子；

9、将处理后的溶液转移至二氧化硅吸附柱中，离心使核酸吸附在二氧化硅膜上；

10、使用高盐-乙醇缓冲液三过柱清洗三次，以有效去除溶液内的有机分子和杂质；

11、再使用乙酸钠-乙醇缓冲液四过柱清洗三次；

12、空转离心吸附柱，甩干膜上残留液体；

13、向膜中央加入洗脱液，离心后得到纯化的尿液样本ctdna。

14、优选的，所述步骤1)中的低盐-缓冲液一中所述低盐为硫酸钾、硫酸钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾中的一种且其工作浓度为50mm-5m，所述乙酸钠的工作浓度为2-50mm，ph值为4.0-7.0。

15、优选的，所述步骤2)中的高盐-缓冲液二中所述高盐为硫酸钾、硫酸钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾中的一种且其工作浓度为50mm-5m，所述乙酸钠的工作浓度为2-50mm，ph值为4.0-7.0。

16、优选的，所述步骤2)中的高盐-乙醇缓冲液三中所述高盐为硫酸钾、硫酸钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾中的一种且其工作浓度为50mm-5m，所述乙醇的工作浓度为60％-95％。

17、优选的，所述步骤2)中的乙酸钠-乙醇缓冲液四中所述乙酸钠的工作浓度为0.1-5m，ph值为4.0-7.0，所述乙醇的工作浓度为60％-95％。

18、优选的，所述步骤2)中的所述洗脱液为depc处理水、te缓冲液、10-100ng/μl的carrier rna溶液中的一种或多种。

19、优选的，所述ctdna为30bp-150bp的片段化ctdna。

20、优选的，所述步骤1)中尿液样本初始上样量为50-200ml；或

21、所述步骤1)中阴离子交换树脂的量为0.2-4ml且阴离子交换树脂为qsepharosehigh performance或q sepharose fast flow或source 30q或wizard pcr preps dnapurification resin中的一种。

22、本发明还有一个目的在于提供一种尿液样本中ctdna的富集方法，包括以下步骤：

23、尿液样本初始上样量为50-200ml，先离心取上清液以去除基因组dna，并向上清液中加入0.2-4ml的阴离子交换树脂，充分混匀后离心得到沉淀的树脂；

24、用低盐-乙酸钠缓冲液一重新悬浮树脂，并转移至干净的50ml离心管中，反复清洗树脂三次，离心弃上清液，得到尿液样本富集后的核酸；

25、所述低盐-乙酸钠缓冲液中的低盐为硫酸钾、硫酸钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾中的一种，其工作浓度为50mm-5m，所述乙酸钠的工作浓度为2-50mm，ph值为4.0-7.0。

26、本发明还有一个目的在于提供一种尿液样本中ctdna的纯化方法，包括以下步骤：

27、向上述清洗完毕的树脂中加入高盐-乙酸钠缓冲液二重新悬浮树脂并离心，将得到的上清液转移至另一干净的50ml离心管中，并向其中加入无水乙醇；

28、将处理后的溶液转移至二氧化硅吸附柱中，离心使核酸吸附在二氧化硅膜上；

29、使用高盐-乙酸钠缓冲液三过柱清洗三次，以有效去除溶液内的有机分子和杂质；

30、再使用乙酸钠-乙醇缓冲液四过柱清洗三次；

31、空转离心吸附柱，甩干膜上残留液体；

32、向膜中央加入30-80μl洗脱液，离心后得到纯化的尿液样本ctdna；

33、所述高盐-缓冲液二中所述高盐为硫酸钾、硫酸钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾中的一种且其工作浓度为50mm-5m，所述乙酸钠的工作浓度为2-50mm，ph值为4.0-7.0；所述高盐-乙醇缓冲液三中所述高盐为硫酸钾、硫酸钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾中的一种且其工作浓度为50mm-5m，所述乙醇的工作浓度为60％-95％；所述乙酸钠-乙醇缓冲液四中所述乙酸钠的工作浓度为0.1-5m，ph值为4.0-7.0，所述乙醇的工作浓度为60％-95％；所述洗脱液为depc处理水、te缓冲液、10-100ng/μl的carrier rna溶液中的一种或多种。

34、本发明还有一个目的在于提供一种用于长久保存上述方法得到的提纯的尿液ctdna的保存液，所述保存液为depc处理水、te缓冲液、10-100ng/μl的carrier rna溶液中的一种或多种。

35、优选地，所述保存液用于权利要求1所述的方法中的洗脱液。

36、与现有技术相比，本发明的优点是：

37、本发明的有效提取过量尿液样本中ctdna的方法，离子交换色谱利用核酸分子净表面电荷和ph之间的关系对核酸和蛋白分子进行分离；以及二氧化硅膜在特定盐离子浓度缓冲液中结合dna的能力，使得尿液样本上样量达到百毫升级别，此方法中尿液样本上样量可提高至百毫升级别，大幅提高ctdna被检测的概率。并对其中的少量ctdna进行浓富集和纯化提取。为液态无创活检提供高质量的、能动态反映肿瘤变化的ctdna来源。(1)大大提高样本上样量，如尿液样本将不限体积；(2)富集样本中含有的少量核酸，使得后续核酸被检出的几率大大提高；(3)提取尿液ctdna的完整性高，包括100bp以下(约80bp)的小片段ctdna，且尿液ctdna中基因突变信息与肿瘤组织检测结果高度一致；(4)提取尿液ctdna的准确性高，可作为完全无创液体活检的分子标志物；(5)反应时间短，操作简单，成本低。