一种人ADAM10pro-domain大肠杆菌表达的优化方法

本发明涉及生物，特别涉及一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法。

背景技术：

1、解聚素金属基质蛋白酶10是一种锌离子依赖的蛋白酶，能够切割notch、多种cadherin、cd44等多种蛋白胞外区与跨膜区临近处的egf样结构域，从而介导跨膜蛋白的胞外区脱落，调控细胞的解聚、迁移以及多种信号的转导。

2、adam10在免疫系统发育、免疫细胞迁移以及炎症信号调控中均发挥重要作用，在肿瘤发病和进展中也有一定作用，靶向adam10的治疗有望为多种炎症及免疫相关疾病乃至肿瘤提供新的治疗手段。但是，adam10缺少良好的小分子抑制剂，现有的adam10抑制剂gi254023x抑制纯的adam10活性高度有效，但在细胞上表现不佳，在动物在体水平对adam10的作用令人失望。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，所述优化方法是通过同义突变替换掉adam10pro-domain天然序列中的稀有密码子，且通过同义突变平衡编码序列的gc含量；

3、所述adam10 pro-domain编码序列的优化位点包括精氨酸atg→cgc/cgt、谷氨酰胺caa→cag、天冬酰胺aat→aac、酪氨酸tat→tac、亮氨酸tta→ctg、亮氨酸cta→ctg、天冬氨酸gat→gac、天冬氨酸gac→gat、丙氨酸gcc→gcg、丙氨酸gca→gcg、精氨酸aga→cgt、精氨酸cga→cgt、精氨酸agg→cgt、苯丙氨酸ttt→ttc、苯丙氨酸ttc→ttt、苏氨酸aca→acc、苏氨酸acc→acg、苏氨酸act→acc、缬氨酸gta→gtg、缬氨酸gtt→gtg、谷氨酸gaa→gag、甘氨酸gga→ggc、甘氨酸ggt→ggc、甘氨酸ggg→ggt、脯氨酸cca→ccg、脯氨酸ccc→ccg、脯氨酸cct→ccg、组氨酸cat→cac、丝氨酸gca→gct、精氨酸agg→cgt、精氨酸aga→cgc/cgt、赖氨酸aaa→aag和精氨酸agg→aga/cgt；

4、需要说明的是，adam10的pro-domain(对应人adam10 cds区)序列如下：

5、ggtcagtatgggaatcctttaaataaatatatcagacattatgaaggattatcttacaatgtggattcattacaccaaaaacaccagcgtgccaaaagagcagtctcacatgaagaccaatttttacgtctagatttccatgcccatggaagacatttcaacctacgaatgaagagggacacttcccttttcagtgatgaatttaaagtagaaacatcaaataaagtacttgattatgatacctctcatatttacactggacatatttatggtgaagaaggaagttttagccatgggtctgttattgatggaagatttgaaggattcatccagactcgtggtggcacattttatgttgagccagcagagagatatattaaagaccgaactctgccatttcactctgtcatttatcatgaagatgatattaactatccccataaatacggtcctcaggggggctgtgcagatcattcagtatttgaaagaatgaggaaataccagatgactggtgtagaggaagtaacacagatacctcaagaagaacatgctgctaatggtccagaacttctgaggaaaaaacgt。

6、pcr扩增该片段并克隆至pgex-4t-1表达载体，转化bl21de3感受态，使用iptg诱导gst-adam10 pro-domain融合蛋白表达，可以获得融合蛋白表达，但表达量非常低，给下一步蛋白的规模化制备造成了困难。通过对人adam10pro-domain的序列进行分析，我们发现可能有两个主要因素制约该蛋白在e.coli内的翻译效率。一是该序列含有较多的稀有密码子，影响蛋白的翻译效率；二是该序列gc含量偏低，可能影响了mrna的稳定性从而影响翻译效率。

7、所述优化是使用10％-25％的过饱和硫酸铵预沉淀杂质，使用30％-50％的过饱和硫酸铵沉淀adam10 pro-domain重组蛋白。

8、优选的，所述优化是根据密码子的简并性，将adam10 pro-domain序列进行密码子优化，包括以下几个步骤：

9、第一步，将a10 prod oprimized 1和a10 prod oprimized 2分别通过bamhi/xhoi双酶切，酶切之后进行胶回收，然后进行纯化；

10、第二步，通过t4连接酶连接bamhi/xhoi酶切纯化后pgex4t-1载体；

11、第三步，取10ul第二步中获取的pgex4t-1载体，转入jm109感受态细胞，先在冰上放置，然后热激，热激之后在冰上继续冷却，冷却之后加入900ul无amp+lb培养基，并进行37℃摇床培养20—40min，然后涂板，最后在37℃下倒置培养12—16h；

12、第四步，挑取单克隆，并扩大培养，之后提取质粒，然后使用bamhi/xhoi酶切验证，验证完成之后测序；

13、第五步，选取酶切及测序结果均正确的质粒，转入bl21感受态细胞按照第三步进行同样操作；

14、第六步，挑取多个单克隆，扩大培养，进行100μm iptg在25℃下诱导8—10h后，取菌液，进行sds-page电泳，并通过考马斯亮蓝染色观察蛋白表达情况。

15、优选的，所述第一步中酶切的温度为37℃，且酶切完整之后静置过夜。

16、优选的，所述第二步中t4连接酶连接完成之后，将得到的产物在室温下放置30—60min。

17、优选的，所述第三步中转入jm109感受态细胞的含量为100ul。

18、优选的，所述第三步中第一次冰上放置的时间为30—60min，所述热激的温度为42℃，且热激90s，之后再次在冰上冷却的时间为2—3min。

19、优选的，所述第六步中染色观察结束之后，再使用不同浓度过饱和硫酸铵进行盐沉，在选取a10 prod oprimized-1扩大培养后，先进行iptg诱导表达，然后在超声裂解菌液后，选择不同浓度的过饱和硫酸铵盐沉提取蛋白，且分别留取iptg诱导前后，超声裂解后上清及包涵体，并对20％、25％、33％、50％和67％浓度的过饱和硫酸铵盐沉后沉淀及上清样品，进行考马斯亮蓝染色。

20、优选的，所述过饱和硫酸铵盐沉结束之后，进行染色观察，然后选取过饱和硫酸铵浓度在33％—50％之间的沉淀进行进一步的优化处理，先使用25％过饱和硫酸铵沉淀杂质，再使用33％-50％过饱和硫酸铵沉淀目的蛋白。

21、优选的，所述进一步优化处理包括以下几个步骤：

22、s1，选取除杂之后的沉淀，先用0.45μm的过滤器过滤，然后使用蛇皮透析袋在4℃下过夜透析；

23、s2，将琼脂糖凝胶4b用gst洗涤缓冲液平衡；

24、s3，将透析好的蛋白与平衡好的琼脂糖凝胶4b分混匀；

25、s4，静置之后，放弃上清液，然后用gst洗涤缓冲液清洗未结合的蛋白；

26、s5，加入谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温混匀后，将上清液转移至超滤管中浓缩；

27、s6，先加入4ml牛凝血酶切割缓冲液重悬浓缩后蛋白，然后加入100u牛凝血酶，在37℃下过夜后切割gst标签；

28、s7，将牛凝血酶切割蛋白缓冲液加入至平衡好的琼脂糖凝胶4b中，室温下混合静置20—30min，之后取上清液至超滤管中浓缩蛋白，进行考马斯亮蓝染色。

29、优选的，所述s3中混合的时间为30—60min，且混合的温度为室温，所述s5中浓缩的转速为30-45r/min。

30、本发明的技术效果和优点：

31、本发明的优化方式是先使用10％-25％的过饱和硫酸铵预沉淀杂质，再使用30％-50％的过饱和硫酸铵沉淀adam10 pro-domain重组蛋白，这样新翻译的adam10蛋白含有一个20kd的pro-domain，该结构域与adam10蛋白酶活性中心结合，抑制adam10的蛋白酶活性。当adam10活化时，adam10的pro-domain被切除，形成具有蛋白酶活性的adam10活性形式。adam10的pro-domain被切割下来后形成可溶性蛋白，仍然保留了与adam10活性中心结合的能力，是adam10内源性的抑制剂。因此，给予外源性重组表达的adam10 pro-domain蛋白是一个行之有效的抑制adam10活性的策略。