一种人ADAM10pro-domain大肠杆菌表达的优化方法

文档序号:37334826发布日期:2024-03-18 17:58阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法,其特征在于,所述优化方法是通过同义突变替换掉adam10 pro-domain天然序列中的稀有密码子,且通过同义突变平衡编码序列的gc含量;

2.根据权利要求1所述的一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法,其特征在于,所述优化是根据密码子的简并性,将adam10pro-domain序列进行密码子优化,包括以下几个步骤:

3.根据权利要求2所述的一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法,其特征在于,所述第一步中酶切的温度为37℃,且酶切完整之后静置过夜。

4.根据权利要求2所述的一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法,其特征在于,所述第二步中t4连接酶连接完成之后,将得到的产物在室温下放置30—60min。

5.根据权利要求2所述的一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法,其特征在于,所述第三步中转入jm109感受态细胞的含量为100ul。

6.根据权利要求2所述的一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法,其特征在于,所述第三步中第一次冰上放置的时间为30—60min,所述热激的温度为42℃,且热激90s,之后再次在冰上冷却的时间为2—3min。

7.根据权利要求2所述的一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法,其特征在于,所述第六步中染色观察结束之后,再使用不同浓度过饱和硫酸铵进行盐沉,在选取a10 prod oprimized-1扩大培养后,先进行iptg诱导表达,然后在超声裂解菌液后,选择不同浓度的过饱和硫酸铵盐沉提取蛋白,且分别留取iptg诱导前后,超声裂解后上清及包涵体,并对20%、25%、33%、50%和67%浓度的过饱和硫酸铵盐沉后沉淀及上清样品,进行考马斯亮蓝染色。

8.根据权利要求7所述的一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法,其特征在于,所述过饱和硫酸铵盐沉结束之后,进行染色观察,然后选取过饱和硫酸铵浓度在33%—50%之间的沉淀进行进一步的优化处理,先使用25%过饱和硫酸铵沉淀杂质,再使用33%-50%过饱和硫酸铵沉淀目的蛋白。

9.根据权利要求8所述的一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法,其特征在于,所述进一步优化处理包括以下几个步骤:

10.根据权利要求9所述的一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法,其特征在于,所述s3中混合的时间为30—60min,且混合的温度为室温,所述s5中浓缩的转速为30-45r/min。


技术总结
本发明公开了一种人ADAM10pro‑domain大肠杆菌表达的优化方法,根据密码子的简并性,将ADAM10pro‑domain序列进行密码子优化,通过同义突变替换掉ADAM10pro‑domain天然序列中的稀有密码子,且通过同义突变平衡编码序列的GC含量,先使用10%‑25%的过饱和硫酸铵预沉淀杂质,再使用30%‑50%的过饱和硫酸铵沉淀ADAM10pro‑domain重组蛋白。本发明翻译的ADAM10蛋白含有一个20kD的pro‑domain,该结构域与ADAM10蛋白酶活性中心结合,抑制ADAM10的蛋白酶活性。当ADAM10活化时,ADAM10的pro‑domain被切除,形成具有蛋白酶活性的ADAM10活性形式。ADAM10的pro‑domain被切割下来后形成可溶性蛋白,仍然保留了与ADAM10活性中心结合的能力,是ADAM10内源性的抑制剂。因此,给予外源性重组表达的ADAM10pro‑domain蛋白是一个行之有效的抑制ADAM10活性的策略。

技术研发人员:陈翀,王聪月,陈茜燏,席静静,祁娜,徐开林
受保护的技术使用者:徐州医科大学
技术研发日:
技术公布日:2024/3/17
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