用于操纵腺毛中的大麻素和其他化合物的毛状体特异性启动子的制作方法

一般而言，本技术涉及来自大麻的大麻素生物合成酶基因的毛状体特异性启动子，该毛状体特异性启动子的核苷酸序列，以及该启动子用于调节大麻素产生或用于调节生物体中生物化学物质的其他毛状体特异性产生的用途。本技术还涉及包含毛状体特异性启动子的转基因细胞和生物体，其包括植物细胞和植物。

背景技术：

1、提供下面的描述以有助于读者理解。提供的信息或引用的参考文献都不被承认是现有技术。

2、植物毛状体是表皮突起，其包括分枝和未分枝的毛、囊泡、钩、刺和螫毛——覆盖叶、苞和茎。有两种主要类型的毛状体，可以根据它们产生和分泌或储存次级代谢物(即，腺毛和非腺毛)的能力来区分。非腺毛表现出低代谢活性并且主要通过物理手段为植物提供保护。相比之下，存在于许多植物物种(包括一些茄科物种(例如烟草、番茄)和大麻)的叶子上的腺毛具有高度代谢活性并积累代谢物，其可占叶干重的多达10-15％(wagner et al.,ann.bot.93:3-11(2004))。腺毛能够分泌(或储存)次级代谢物作为防御机制。

3、大麻(cannabis sativa l.)(大麻(cannabis)、大麻(hemp)、大麻(marijuana))是一种已经栽培了数千年的一年生草本植物，其含有一组独特的次级代谢物，称为大麻素，其构成一组单萜基团分子(terpenophenolics)。大麻素主要在腺毛中合成并积累，所述腺毛在雌花上以高密度存在并且在大麻植物的雄花上以较低密度存在。大麻素在毛状体贮藏腔中的积累对植物有益，因为已知大麻素对其他植物细胞具有细胞毒性，并已显示在大麻和烟草细胞悬浮培养物二者中诱导细胞凋亡(sirikantaramas et al.,plant cellphysiol.46:1578-1582(2005))。大麻素通过三步生物合成过程形成：聚酮化合物形成、芳香族异戊二烯化和环化(图1)。大麻素途径由己酰基-coa提供，所述己酰基-coa的形成由己酰基-coa合成酶催化。大麻素生物合成中的第一个酶促步骤是由四酮体(tetraketide)合成酶(tks)(称为橄榄醇酸(olivetolic acid)合成酶(ols1))形成3,5,7-三氧代癸酰-coa。大麻素生物合成中的第二个酶促步骤是通过橄榄醇酸环化酶(oac)形成橄榄醇酸。下一步是通过芳香族异戊烯转移酶使橄榄醇酸异戊二烯化形成大麻萜酚酸(cbga)。cbga是不同主要种类的大麻素生物合成的中心分支点中间体。cbga的异戊二烯基侧链的可选环化产生δ9四氢大麻酚酸(thca)或其异构体，大麻二酚酸(cbda)或大麻色烯酸(cbca)。thca和cbda随后在储存或吸烟(smoking)期间通过非酶促反应脱羧，以分别产生δ9-四氢大麻酚(thc)或大麻二酚(cbd)(图1)。

4、大麻素是有价值的植物来源的天然产物。大麻制品，如大麻和麻药，因为它们众所周知的精神活性作用已经使用了几个世纪。大麻素因其通过哺乳动物大麻素受体起作用的能力而引起了对医学应用的新兴趣。主要的大麻素包括δ9-四氢大麻酚(thc)——负责大麻消耗的精神活性和治疗作用的化合物；和大麻二酚(cbd)，其具有神经保护特性。(gaoni&mechoulam,j.am.chem.soc.86:1646-1647(1964)；mechoulam et al.,j.clin.pharmacol.42:11s-19s(2002))。thca是大麻的药物品种中的主要大麻素，而cbda是纤维或种子生长的大麻形式的主导大麻素。目前正在研究大麻素用于治疗目的，包括治疗慢性疼痛、恶心，控制患有多发性硬化或癫痫的患者的痉挛状态和震颤，以及治疗关节炎。在毛状体中引导大麻素生成的可能性避免了对植物代谢途径和性能的干扰。因此，需要鉴定毛状体特异性启动子以调节生物体——包括转基因植物、转基因细胞及其衍生物——中大麻素的合成，其允许特异性地在毛状体中靶向基因表达。

技术实现思路

1、本文公开了毛状体特异性启动子和这些启动子用于引导编码核酸序列在植物毛状体中表达的用途。

2、在一个方面，本公开内容提供了合成dna分子，其包含选自下列的核苷酸序列：(a)在seq id no:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个中列出的核苷酸序列；和(b)与seq id no:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列，并且其编码具有植物毛状体腺(trichome gland)特异性转录活性的启动子，和其中所述核苷酸序列与异源核酸可操作地连接。

3、在一些实施方式中，本公开内容提供了表达载体，其包含与编码多肽的一种或多种核酸序列可操作地连接的合成dna分子。

4、在一些实施方式中，本公开内容提供了包含表达载体的遗传工程化宿主细胞。在一些实施方式中，遗传工程化宿主细胞是大麻细胞(cannabis sativa cell)。在一些实施方式中，遗传工程化宿主细胞是烟草细胞(nicotiana tabacum cell)。

5、在一些实施方式中，本公开内容提供了遗传工程化植物，其包含含有嵌合核酸构建体的细胞，所述嵌合核酸构建体包含合成dna分子。在一些实施方式中，遗传工程化植物属于茄科。在一些实施方式中，工程化茄科植物是烟草植物。在一些实施方式中，遗传工程化植物属于大麻科。在一些实施方式中，工程化大麻科植物是大麻植物。在一些实施方式中，本公开内容提供来自遗传工程化植物的种子，其中种子包含嵌合核酸构建体。

6、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:1中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:1的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

7、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:2中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:2的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

8、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:3中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:3的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

9、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:5中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:5的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

10、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:6中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:6的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

11、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:8中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:8的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

12、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:9中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:9的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

13、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:11中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:11的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

14、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:12中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:12的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

15、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:13中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:13的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

16、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:14中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:14的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

17、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:16中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:16的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

18、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:17中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:17的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

19、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:18中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:18的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

20、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:19中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:19的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

21、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:21中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:21的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

22、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:22中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:22的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

23、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:23中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:23的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

24、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:24中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:24的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

25、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:25中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:25的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

26、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:26中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:26的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

27、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:28中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:28的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

28、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:29中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:29的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

29、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:31中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:31的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

30、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:32中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:32的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

31、在一些实施方式中，本公开内容提供了具有如在seq id no:33中列出的核苷酸序列的合成dna分子。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有与seq id no:33的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列的合成dna分子，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

32、在一个方面，本公开内容提供了遗传工程化植物或植物细胞，其包含整合到其基因组中的嵌合基因，该嵌合基因包含与同源或异源核酸序列可操作地连接的毛状体特异性启动子，其中该启动子选自：(a)seq id no:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个的核苷酸序列；和(b)与seq id no:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子。

33、在一些实施方式中，遗传工程化植物或植物细胞属于茄科。在一些实施方式中，茄科植物是烟草。在一些实施方式中，遗传工程化植物属于大麻科。在一些实施方式中，工程化大麻科植物是大麻。

34、在一个方面，本公开内容提供了用于在植物毛状体中表达多肽的方法，其包括(a)将包括如此核苷酸序列的表达载体引入宿主细胞，所述核苷酸序列选自：(i)在seq id no:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个中列出的核苷酸序列；和(ii)与seq id no:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子；其中(i)或(ii)的核酸序列可操作地连接至编码多肽的一种或多种核酸序列；和(b)在允许多肽表达的条件下使植物生长。

35、在另一个方面，本公开内容提供了用于增加宿主植物毛状体中的大麻素的方法，其包括(i)将包括如此核苷酸序列的表达载体引入宿主细胞，所述核苷酸序列选自：(a)在seq id no:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个中列出的核苷酸序列；和(ii)与seq id no:1-3、5、6、8、9、11-14、16-19、21-26、28、29或31-33中任一个的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子；其中(i)或(ii)的核酸序列可操作地连接至编码大麻素生物合成途径的酶的一种或多种核酸序列；和(b)在允许大麻素生物合成途径酶表达的条件下使植物生长；其中大麻素生物合成途径酶的表达导致相对于在类似条件下生长的对照植物具有增加的大麻素含量。

36、在该方法的一些实施方式中，大麻素生物合成途径酶是大麻二酚酸(cbda)合成酶、大麻色烯酸(cbca)合成酶或δ9四氢大麻酚酸(thca)合成酶。

37、在一些实施方式中，该方法进一步包括给植物提供大麻萜酚酸(cbga)。

38、在一些实施方式中，本公开内容提供了用于产生遗传工程化植物的方法，所述遗传工程化植物相对于对照植物具有增加的δ9-四氢大麻酚(thc)、大麻色原烯(cbc)和/或大麻二酚(cbd)含量。

39、本文描述和要求保护的技术具有许多属性和实施方式，其包括但不限于本
技术实现要素：
中阐述或描述或引用的那些。其并非旨在包括所有内容，并且本文描述和要求保护的发明不限于本发明内容中标识的特征或实施方式或被其限制，包括其仅出于说明的目的而不是限制的目的。可以在下面的具体实施方式中公开另外的实施方式。

40、在一个方面，本公开内容提供了包括核苷酸序列的合成dna分子，所述核苷酸序列选自：(a)在seq id no:31、32或33中任一个中列出的核苷酸序列；和(b)与seq id no:31、32或33中任一个的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列，并且其编码具有植物毛状体腺特异性转录活性的启动子，其中核苷酸序列可操作地连接至异源核酸。

41、在一些实施方式中，本公开内容提供了表达载体，其包含与编码多肽的一种或多种核酸序列可操作地连接的合成dna分子。

42、在一些实施方式中，本公开内容提供了包含表达载体的遗传工程化宿主细胞。在一些实施方式中，遗传工程化宿主细胞是大麻细胞。在一些实施方式中，遗传工程化宿主细胞是烟草细胞。

43、在一些实施方式中，本公开内容提供了遗传工程化植物，其包含含有嵌合核酸构建体的细胞，所述嵌合核酸构建体包含合成dna分子。在一些实施方式中，工程化植物是烟草植物。在一些实施方式中，工程化植物是大麻植物。

44、在一些实施方式中，本公开内容提供了来自5的任一种的工程化植物的种子，其中所述种子包括嵌合核酸构建体。

45、在一个方面，本公开内容提供了包括如在seq id no:33中列出的核苷酸序列的合成dna分子。

46、在一些实施方式中，本公开内容提供了表达载体，其包含与编码多肽的一种或多种核酸序列可操作地连接的合成dna分子。

47、在一些实施方式中，本公开内容提供了包含表达载体的遗传工程化宿主细胞。在一些实施方式中，遗传工程化宿主细胞是大麻细胞。在一些实施方式中，遗传工程化宿主细胞是烟草细胞。

48、在一些实施方式中，本公开内容提供了遗传工程化植物，其包含含有嵌合核酸构建体的细胞，所述嵌合核酸构建体包含合成dna分子。在一些实施方式中，工程化植物是烟草植物。在一些实施方式中，工程化植物是大麻植物。

49、在一些实施方式中，本公开内容提供了来自工程化植物的种子，其中种子包含嵌合核酸构建体。