牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型S4蛋白、试剂盒及应用

本发明属于生物，具体涉及一种牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型s4蛋白、试剂盒及应用。

背景技术：

1、呼肠孤病毒(mammalian reovirus,牛哺乳动物正呼肠孤病毒)是双股rna病毒，属于呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属，哺乳动物呼肠孤病毒主要感染牛、羊、人等一系列哺乳动物，感染的物种种类比较多，且由于其他动物的牛哺乳动物正呼肠孤病毒与人的亲缘性很高，在一定程度上危害人类的健康。

2、目前牛哺乳动物正呼肠孤病毒的相关研究较少，并且检测方法较少，阻碍了牛群中牛哺乳动物正呼肠孤病毒抗体和临床样品检测。间接elisa方法因为操作方便，快速，特异性高的特点，可以快速同时检测大批量的临床血清样品，国内外关于牛牛哺乳动物正呼肠孤病毒抗体检测的间接elisa方法报道少，因此通过建立牛牛哺乳动物正呼肠孤病毒间接elisa的方法，方便于牛牛哺乳动物正呼肠孤病毒的检测。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型s4蛋白、试剂盒及应用，目的在于使用的包被蛋白为分离到的三型牛哺乳动物正呼肠孤病毒表达的结构蛋白s4蛋白，利用s4结构蛋白特异性与牛哺乳动物正呼肠孤病毒产生的抗体相结合的特点，用来筛选牛是否感染牛哺乳动物正呼肠孤病毒，表达牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型s4蛋白建立间接elisa方法有助于实现对牛哺乳动物正呼肠孤病毒的高效，灵敏的检测，为牛哺乳动物正呼肠孤病毒的流行病学调查提供技术支持，有助于对牛牛哺乳动物正呼肠孤病毒感染的防控，以解决现有技术中关因检测方法少，不利于及时检测到牛哺乳动物正呼肠孤病毒，造成无法及时治疗的问题。

2、为了实现上述目的，本发明的具体方案如下：

3、牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型s4蛋白，编码所述s4蛋白的核苷酸序列如seq.id.no.1所示，氨基酸序列如seq.id.no.2所示。

4、一种所述的牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型s4蛋白的制备方法，包括如下步骤：

5、s1.提取牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型分离株的病毒总rna，并反转录成cdna；并以cdna为模板，扩增s4蛋白基因；

6、s2.对步骤s1扩增的产物进行回收，大小为1067bp；将回收的目的片段与pet-32a载体同时进行双酶切，回收酶切产物；将回收的目的片段与pet-32a载体在t4连接酶的作用下16℃过夜连接，转化至dh5α感受态细胞，挑取单个菌落进行培养；

7、s3.将培养的单克隆菌落进行菌液pcr鉴定阳性菌液，挑选阳性菌扩大培养并抽提重组蛋白pet-32a-s4基因；

8、s4.将重组蛋白pet-32a-s4基因转化至bl21感受态细胞，挑取单一菌落培养并进行pcr鉴定为阳性的菌液扩大培养，按照1：100的比例将5ml阳性菌液加入到500ml含有氨苄青霉素的lb培养基中，振荡培养至0d600为0.5时，加入iptg终浓度为0.75mmol/l,16℃继续培养过夜；离心收集菌体，将菌体用pbs重悬，在超声破碎仪下超声裂解,超声后4℃12000rpm离心10min,收集沉淀,将沉淀用8m尿素4℃溶解两天；

9、s5.选用ni-nta琼脂糖树脂对重组蛋白pet-32a-s4基因进行纯化,即得纯化后的牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型s4蛋白。

10、用于检测牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型分离毒株的包被抗原，所述包被抗原包括所述的牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型s4蛋白。

11、如所述的包被抗原在制备检测牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型分离毒株的检测试剂中的应用。

12、一种牛哺乳动物正呼肠孤病毒s4蛋白间接elisa抗体检测试剂盒，包括包被酶标板，所述包被酶标板以牛哺乳动物正呼肠孤病毒s4蛋白作为包被抗原，还包括牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型阳性血清、阴性血清，hrp-山羊抗牛igg，包被液，洗涤液，封闭液，显色液和终止液；包被液为elisa包被液缓冲液，洗涤液为pbst洗涤液，封闭液为1％脱脂奶粉，5％脱脂奶粉，显色液为tmb显色液，终止液为elisa终止液；洗涤液的配制为：pbs粉末加2l纯净水加1000μl的tween-20。

13、一种以非诊断目的的牛哺乳动物正呼肠孤病毒s4蛋白间接elisa检测方法，包括如下步骤：

14、步骤1，包被抗原：将牛哺乳动物正呼肠孤病毒s4蛋白用包被液稀释,4℃的条件下包被12h，然后用pbst洗去未结合的抗原及杂质；

15、步骤2，封闭：加入5％脱脂奶粉作为封闭液，在37℃的条件下封闭2h，然后弃去封闭液，并用pbst洗去残余的封闭液；

16、步骤3，加入待检血清：将待检血清倍比稀释，37℃孵育1h，反应后用pbst洗涤；

17、步骤4，加酶标二抗：将hrp-山羊抗牛igg按稀释,37℃孵育40min，反应后用pbst洗涤；显色和测定：加tmb显色液避光显色30min后加入终止液，在酶标仪450nm波长下进行读数；s4蛋白以200ng/孔包被，待检血清按1:500稀释；待检血清作用时间为60min，酶标二抗作用时间为45min；包被抗原条件为4℃过夜，二抗稀释度为1:5000或1:10000；封闭液为5％脱脂奶粉，封闭时间为2h，显色时间为30min。

18、扩增牛哺乳动物正呼肠孤病毒结构重组蛋白pet-32a-s4基因的引物，包括特异性引物对，所述特异性引物对为序列表seq.id.no.3和seq.id.no.4的碱基序列。

19、所述的扩增牛哺乳动物正呼肠孤病毒结构重组蛋白pet-32a-s4基因的引物在rt-pcr扩增中的应用。

20、一种牛哺乳动物正呼肠孤病毒结构重组蛋白pet-32a-s4重组表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：

21、s1，利用序列表seq.id.no.3和seq.id.no.4的碱基序列的特异性引物对通过rt-pcr扩增牛哺乳动物正呼肠孤病毒结构重组蛋白pet-32a-s4基因；

22、s2，将步骤s1所得的基因融合到质粒载体pet-32a中，获得重组质粒pet-32a-s4；

23、s3，将步骤s2所构建的重组质粒转化到宿主菌并诱导表达，获取菌液；

24、s4，筛选步骤s3中携带牛哺乳动物正呼肠孤病毒结构重组蛋白pet-32a-s4基因的重组菌，在iptg诱导下大量表达与his融合的牛哺乳动物正呼肠孤病毒结构重组蛋白pet-32a-s4；

25、s5，利用his标签镍柱亲和层析柱纯化，获得提纯后的牛哺乳动物正呼肠孤病毒结构重组蛋白pet-32a-s4。

26、本发明的优点

27、本发明提供的牛哺乳动物正呼肠孤病毒elisa抗体检测引物、试剂盒及应用，通过研究设计了牛哺乳动物正呼肠孤病毒s4蛋白，由序列表seq.id.no.3的基因碱基序列编码和seq.id.no.4的氨基酸序列。牛哺乳动物正呼肠孤病毒的结构蛋白s4蛋白含有部分抗原表位，因此选取这段基因进行扩增,克隆至pet-32a载体进行表达获得重组蛋白。根据分离株高通量测序结果设计特异性引物扩增目的片段，构建s4的原核表达质粒,获得重组蛋白并制备了多克隆抗体，同时与s4蛋白建立了间接elisa检测方法。所得重组蛋白具有抗原性好、免疫原性强的特点,elisa检测方法操作简单，特异性强，重复性好，敏感度高，能用于检测并准确判断牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型的感染情况，应用前景良好。综上，本发明为牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型的流行病学调查提供技术手段，为牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型感染提供新型快速的血清学检测方法。