一种检测非洲猪瘟病毒的扩增引物对、试剂盒及检测方法

本发明属于病毒检测，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒的扩增引物对、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus,asfv)感染所引起的一种高度接触性传染病。除非洲犹猪、丛林猪和巨型森林猪以外的所有年龄阶段的猪对asfv均易感，随着感染毒株毒力的不同，表现急性、亚急性、慢性和无症状隐性感染等不同症状，其中急性型死亡率高达100％，也是国内最常见的临床发病类型。asfv速度传播极快，给我国养猪业造成巨大的经济损失。

2、目前asf防控的难点在于：病毒粒子对外界环境和普通消毒剂抵抗力强，导致难以被清除，并保持长时间感染力；传染源和传播途径多，当环境中的病毒污染达到一定程度后，将很难阻止病毒侵入猪场；作为asfv的防疫主体，猪场生物安全水平普遍较低，且没有有效的商品疫苗和药物来保护易感动物。asf现有的防控技术十分薄弱，生物安全措施、早期检测、早期发现和淘汰带毒猪是目前防控该病的主要方法。

3、pcr检测方法被视为asfv早期检测的金标准，具有卓越的敏感性、特异性和高通量特性。现已开发出upl荧光定量pcr、taqman荧光定量pcr及普通pcr等多种方法，其中前两种荧光定量pcr方法具有敏感性高的特点，但同时也存在易污染，可能导致假阳性结果的缺点；sybr green荧光定量pcr方法作为一种操作简单、成本相对低廉的荧光定量pcr方法，被广泛用于试验室样本相关基因的检测，但至今都没有建立非洲猪瘟病毒sybr green荧光定量pcr方法的报道。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种检测非洲猪瘟病毒的扩增引物对、试剂盒及检测方法，建立了非洲猪瘟病毒sybr green荧光定量pcr检测方法，并具有特异性强、重复性好和敏感度高的优点，解决了缺少非洲猪瘟病毒sybr green荧光定量pcr方法的问题。

2、为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种检测非洲猪瘟病毒的扩增引物对，包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如seq idno.1所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3、本发明还提供了检测非洲猪瘟病毒的扩增引物对在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。

4、本发明还提供了一种sybr green荧光定量pcr检测试剂盒，包括阳性标准质粒和检测非洲猪瘟病毒的扩增引物对，阳性标准质粒为含有非洲猪瘟b646l基因的质粒。

5、进一步，阳性标准质粒为含有非洲猪瘟b646l基因的pmd19-t质粒。

6、本发明还提供了sybr green荧光定量pcr检测试剂盒在检测非洲猪瘟病毒中的应用。

7、本发明还提供了一种非洲猪瘟病毒的sybr green qpcr检测方法，使用上述sybrgreen荧光定量pcr检测试剂盒，包括以下步骤：

8、(1)提取待测样品的基因组dna，得待测样品dna；

9、(2)分别以阳性标准质粒和步骤(1)所得待测样品dna为模板dna，配置反应体系，反应体系包括2×realstar green power mixture、正向引物、反向引物、ddh2o和模板dna；

10、(3)设置反应程序进行sybr green荧光定量pcr反应，并采集荧光信号；

11、(4)根据荧光信号判定检测结果。

12、进一步，步骤(2)中，反应体系中2×realstar green power mixture、正向引物、反向引物、ddh2o和模板dna的体积比为10μl：0.4μl：0.4μl：7.2μl：2μl，正向引物和反向引物浓度均为20μmol/l。

13、进一步，步骤(3)中，反应程序为：95℃2min；95℃15s，60℃1min，45cycles；95℃10s；65℃5s。

14、进一步，将阳性标准质粒稀释为系列已知浓度进行sybr green荧光定量pcr反应，绘制标准扩增曲线，计算待测样品中dna含量。

15、综上所述，本发明具有以下优点：

16、1、本发明基于asfv的b646l基因设计扩增引物对，该扩增引物对仅对asfv产生特异性扩增，不与猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪瘟病毒(csfv)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、传染性胃肠炎病毒(tgev)和日本乙型脑炎病毒(jev)的阳性cdna及ii型圆环病毒(pcv2)、猪细小病毒(ppv)、猪伪狂犬病毒(prv)、支气管败血波氏杆菌(bb)和肺炎支原体(mh)的阳性dna产生非特异性扩增，具有特异性高的优点。

17、2、本发明非洲猪瘟病毒的sybr green qpcr检测方法，能检测的最低浓度为5.05×102copies/μl，组内与组间的重复性试验变异系数均小于2％，该方法具有敏感度高，重复性好的优点.

18、3、本发明非洲猪瘟病毒的sybr green qpcr检测方法对唾液样品中asfv的检出率为40％，对血液样品的检出率为70.83％，低于upl荧光定量pcr对唾液及血液样品的检出率100％，不适合用于临床样品中asfv的检测；但该方法对asfv细胞培养物样品的检出率为100％，与taqman荧光定量pcr方法(gb/t 18648-2020)一致，该检测方法适用于asfv细胞培养物样品的检测，该方法是一种特异、灵敏、价廉的荧光定量pcr检测方法，可用于实验室中asfv细胞培养物样品的检测。

技术特征：

1.一种检测非洲猪瘟病毒的扩增引物对，其特征在于，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。

2.权利要求1所述的检测非洲猪瘟病毒的扩增引物对在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。

3.一种sybr green荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，包括阳性标准质粒和权利要求1所述的检测非洲猪瘟病毒的扩增引物对，所述阳性标准质粒为含有非洲猪瘟b646l基因的质粒。

4.如权利要求3所述的sybr green荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准质粒为含有非洲猪瘟b646l基因的pmd19-t质粒。

5.权利要求3或4所述的sybr green荧光定量pcr检测试剂盒在检测非洲猪瘟病毒中的应用。

6.一种非洲猪瘟病毒的sybr green qpcr检测方法，其特征在于，使用权利要求3或4所述的sybr green荧光定量pcr检测试剂盒，包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的非洲猪瘟病毒的sybr green qpcr检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述反应体系中2×realstar green power mixture、正向引物、反向引物、ddh2o和模板dna的体积比为10μl：0.4μl：0.4μl：7.2μl：2μl，正向引物和反向引物浓度均为20μmol/l。

8.如权利要求6所述的非洲猪瘟病毒的sybr green qpcr检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述反应程序为：95℃2min；95℃15s，60℃1min，45cycles；95℃10s；65℃5s。

9.如权利要求6所述的非洲猪瘟病毒的sybr green qpcr检测方法，其特征在于，将所述阳性标准质粒稀释为系列已知浓度进行sybr green荧光定量pcr反应，绘制标准扩增曲线，计算待测样品中dna含量。

技术总结
本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒的扩增引物对、试剂盒及检测方法，涉及病毒检测技术领域，该检测非洲猪瘟病毒的扩增引物对包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种非洲猪瘟病毒的检测试剂盒及SYBR Green qPCR检测方法。本发明建立了非洲猪瘟病毒SYBR green荧光定量PCR检测方法，并具有特异性强、重复性好和敏感度高的优点，解决了缺少非洲猪瘟病毒SYBR green荧光定量PCR方法的问题。

技术研发人员：刘远佳,陈建新,亓文宝,张桂红,张新珩,刘泽鑫,区玮欣,朱君海
受保护的技术使用者：广东海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4