一种检测过氧亚硝酸根离子的近红外荧光分子探针及其合成方法和应用

本发明属于分析检测，具体涉及一种新的检测过氧亚硝酸根离子(onoo-)的近红外荧光分子探针及其合成方法和应用。

背景技术：

1、过氧亚硝酸根离子(onoo-)由于其高氧化和硝化应激，除了与各种病理过程相关外，还与多种生理过程相关，包括神经退行性疾病、癌症等相关的生理过程。因而，对于过氧亚硝酸根离子的准确检测对于疾病的诊断以及病理过程的研究具有重要的意义。

2、荧光探针由于具有高特异性、高灵敏度监测功能和响应时间迅速等优势，因此已成为化学传感、环境科学、生物成像和医学诊断等众多应用中的强大工具。在已经报道的用于检测onoo-的荧光探针中，芳基硼酸盐荧光探针因其可以与onoo-快速响应的特性成为了一种理想的检测onoo-的工具，备受研究者青睐。2014年，kim课题组利用香豆素染料的类似物苯并噻唑亚胺香豆素作为荧光团，设计了一种监测onoo-的新型荧光探针，该探针具有优异的光稳定性和高的荧光量子产率。2019年，wang等人利用苯并噻唑香豆素作为荧光团，设计了一种响应onoo-的新型荧光探针，该探针对于onoo-表现出较好的选择性和高的灵敏度。然而，研究发现，将芳基硼酸盐荧光探针用于复杂环境中onoo-的检测时，芳基硼酸盐探针普遍存在选择性差、稳定性差发射波长较短等问题。

3、因此，开发出新的、高选择性、高稳定性的荧光探针用于onoo-的体外和体内检测是非常重要的。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种新型的检测过氧亚硝酸根离子(onoo-)的近红外荧光探针，具有生物兼容性好、检测灵敏度高、选择性好的特点。

2、本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

3、一种新的检测过氧亚硝酸根离子(onoo-)的近红外小分子荧光探针(缩写为hdm-bn)，其结构通式如下：

4、

5、上述检测过氧亚硝酸根离子(onoo-)的近红外荧光分子探针hdm-bn的合成方法，包括如下步骤：

6、(1)异氟尔酮和丙二腈在弱碱哌啶的催化作用下发生亲核加成反应，制得化合物1；

7、(2)化合物1与3-氯-4-羟基苯甲醛在弱碱哌啶的催化作用下发生knoevenagel反应(克脑文盖尔缩合反应)，得到化合物2；

8、(3)化合物3与4-溴甲基苯硼酸在k2co3的作用下发生亲核取代反应，制得化合物3；

9、(4)化合物3和1,8-萘二胺在高温条件下发生脱水缩合反应，得到检测过氧亚硝酸根离子(onoo-)的近红外荧光分子探针hdm-bn。具体合成路线如下：

10、

11、上述检测过氧亚硝酸根离子(onoo-)的近红外荧光分子探针hdm-bn的合成方法，具体步骤如下：

12、(1)先将异氟尔酮和丙二腈溶于无水乙醇中，然后逐滴加入哌啶在70-80℃反应10-15h；反应结束后，将所得溶液倒入冰水中冷却沉淀1-2h，减压过滤得到黑色固体，然后用异丙醇和水重结晶，真空干燥后即得化合物1；

13、(2)化合物1和3-氯-4-羟基苯甲醛溶于乙腈中，逐滴加入少量哌啶，在70-90℃条件下回流反应5-8h；反应结束后减压旋蒸除去溶剂，柱层析纯化得到化合物2；

14、(3)化合物2、4-溴甲基苯硼酸和碳酸钾在溶剂n，n-二甲基甲酰胺中混合，在保护气氛下70-90℃继续搅拌反应15-25h；反应结束后用水和乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，得到化合物3；

15、(4)将化合物3和1,8-萘二胺溶于甲苯中，在110-130℃和保护气氛下反应4-6h，反应结束后用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，粗产物用柱层析纯化，得到近红外荧光分子探针hdm-bn。

16、按上述方案，步骤(1)中，异氟尔酮和丙二腈的摩尔比为1：(1-1.5)；异氟尔酮和无水乙醇的用量比为20mmol：(20-40)ml，哌啶的加入质量为异氟尔酮的10％-15％；重结晶采用异丙醇和水按体积比(6-10)：3组成的混合溶剂。

17、按上述方案，步骤(2)中，化合物1、3-氯-4-羟基苯甲醛和哌啶的摩尔比为1：(1-1.5)：(1.5-2.5)；以乙腈作溶剂，化合物1与乙腈的用量比为1mmol：(3-5)ml；柱层析纯化采用的淋洗剂由石油醚(pe)和乙酸乙酯(ea)按体积比(5-10)：1组成。

18、按上述方案，步骤(3)中，化合物2和4-溴甲基苯硼酸、碳酸钾的摩尔比为1：(2-3)：(4-6)；化合物2在溶剂n，n-二甲基甲酰胺中的浓度为0.04-0.06mmol/ml；萃取溶剂为乙酸乙酯和水，两者体积比为(1-2)：1。

19、按上述方案，步骤(4)中，化合物3与1，8-萘二胺的摩尔比为1：(1-2)，以甲苯为溶剂，化合物3在甲苯中的浓度为0.01-0.03mmol/ml；柱层析纯化采用的淋洗剂由石油醚(pe)和乙酸乙酯(ea)按体积比(5-15)：1组成。

20、本发明所述近红外荧光分子探针hdm-bn可以在近红外区检测体外和体内的过氧亚硝酸根离子(onoo-)，应用方法为：将荧光分子探针hdm-bn加入到待测溶液或者细胞中，通过实时观察荧光强度的改变对过氧亚硝酸根离子(onoo-)进行动态监测以及定量分析检测。

21、本发明所述近红外荧光分子探针hdm-bn的技术构思如下：

22、本发明所述近红外荧光分子探针hdm-bn是一种新的、稳定性好的onoo-响应型芳基硼酸盐荧光探针。在化合物2(荧光团)中，丙二腈部分作为电子受体，苯酚部分作为电子供体，两者之间的ict效应使得化合物2表现出明显的近红外发射；在化合物2上桥连4-溴甲基苯硼酸和1，8-萘二胺后，ict效应减弱，荧光强度降低、发射波长蓝移；在hdm-bn与onoo-相互作用时，onoo-选择性的进攻b原子，在经过电子转移后发生分子内的自消除，释放出近红外荧光团hdm，从而实现荧光增强，达到检测onoo-的目的。本发明所述荧光探针hdm-bn具有生物兼容性好、检测灵敏，度高、抗干扰能力强等特点。

23、本发明所述近红外荧光分子探针hdm-bn所用识别域与传统芳基硼酸盐探针常用的识别域4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯相比，对于荧光团ict效应削弱更明显，在onoo-检测时表现出更高的信噪比。

24、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

25、1、与传统的芳基硼酸盐探针相比，本发明所述检测过氧亚硝酸根离子(onoo-)的荧光分子探针具有更好的选择性，表现出更强的抗干扰能力，更高的灵敏度等特点，并且发射波长较长(＞650nm)，具有很好的生物活体成像潜力。

26、2、本发明所述近红外荧光分子探针hdm-bn的合成过程简单，合成成本低，合成产率较高，具有较高的实际应用价值和经济效益。

27、3、本发明所述近红外荧光分子探针具有高的信噪比和生物安全性，可以用于体外和体内特异性检测onoo-以及实时跟踪监测。