运输蛋白新型变体及利用其的L-芳香族氨基酸的生产方法与流程

本发明涉及运输蛋白新型变体及利用其的l-芳香族氨基酸的生产方法。

背景技术：

1、氨基酸根据侧链的性质而分为疏水性、亲水性、碱性和酸性氨基酸，将它们中具有苯环的氨基酸称为芳香族氨基酸。在芳香族氨基酸中，有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，苯丙氨酸和色氨酸是生物体内不能合成的必要氨基酸，属于在全世界每年形成着3000亿美元规模的市场的高附加值产业。

2、芳香族氨基酸的生产可以利用自然状态下获得的野生型菌株或者以提高其氨基酸生产能力的方式改变的变异株。近年来，为了改善芳香族氨基酸的生产效率，以多用于l-氨基酸之类的有用物质的生产的大肠杆菌、棒状杆菌等微生物为对象，适用基因重组技术，从而开发了具有优异的l-芳香族氨基酸生产能力的各种重组菌株或变异株及利用其的l-芳香族氨基酸的生产方法。特别是，进行了如下尝试：以参与l-芳香族氨基酸的生物合成途径的酶、转录因子、运输蛋白等的基因为靶向、或者对调控它们的表达的启动子诱导变异，从而扩大相应氨基酸的生产量。但是，与l-芳香族氨基酸生产直接或间接相关的酶、转录因子、运输蛋白等蛋白质的种类达到数十余种，因此关于根据这样的蛋白质的活性变化的l-芳香族氨基酸生产能力是否增加，事实上仍需要大量的研究。

3、现有技术文献

4、专利文献

5、韩国授权专利第10-1830002号

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供新型的运输蛋白变体。

2、另外，本发明提供编码上述变体的多核苷酸。

3、另外，本发明提供包含上述变体或多核苷酸的转化体。

4、另外，本发明的目的在于提供利用了上述转化体的l-芳香族氨基酸的生产方法。

5、本发明的一个方式提供选自以下变体中的变体：铵运输蛋白变体，由seq id no:1的氨基酸序列组成，是seq id no:3的氨基酸序列中的第363号甘氨酸被置换为天冬氨酸而成的；腺嘌呤运输蛋白变体，由seq id no:5的氨基酸序列组成，是seq id no:7的氨基酸序列中的第136号色氨酸被置换为终止密码子而成的；以及fmn/fad运输蛋白变体，由seq idno:9的氨基酸序列组成，是seq id no:11的氨基酸序列中的第272号甘氨酸被置换为谷氨酰胺而成的。

6、本发明中所使用的“运输蛋白(transporter)”是负责通过细胞膜而移动离子、化学物质、蛋白质等各种物质的蛋白质的总称，运输蛋白对被运输的物质具有特异性。这样的运输蛋白大致分为通道蛋白质和转运体蛋白质，上述通道蛋白质在膜上形成贯通内部和外部的孔而成为物质的移动通道，上述转运体为通过蛋白质的结构性变形使转运物质的结合部位跨膜而移动的运输体。

7、本发明中所使用的“铵运输蛋白”、“腺嘌呤运输蛋白”和“fmn/fad运输蛋白”均相当于转运体蛋白质，分别具有只使铵、腺嘌呤和fmn(黄素单核苷酸(flavinmononucleotide))/fad(黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide))特异性外排的特性。

8、上述运输蛋白可以是编码各运输蛋白的基因或与其具有实质同一性的序列。在这里，“实质同一性”是指在将各个基因序列，即碱基序列或核苷酸序列和任意的其它核苷酸序列以最大程度对应的方式对齐而进行分析时，上述任意的其它核苷酸序列和各个核苷酸序列具有70％以上、80％以上、90％以上或98％以上的序列同源性。

9、本发明中的铵运输蛋白是利用amtb基因编码而成的，包含seq idno:3的氨基酸序列。

10、根据本发明的一具体例，上述seq id no:3的氨基酸序列可以源于野生型大肠杆菌。

11、本发明中的腺嘌呤运输蛋白是利用yico基因编码而成的，包含seq id no:7的氨基酸序列。

12、根据本发明的一具体例，上述seq id no:7的氨基酸序列可以源于野生型大肠杆菌。

13、本发明中的fmn/fad运输蛋白是利用yeeo基因编码而成的，包含seq id no:11的氨基酸序列。

14、根据本发明的一具体例，上述seq id no:11的氨基酸序列可以源于野生型大肠杆菌。

15、本发明中所使用的“变体”是指如下的多肽，该多肽的特定基因的氨基酸序列的n-末端、c-末端和/或内部中的一个以上的氨基酸被保守性置换(conservativesubstitution)和/或改变(modification)，从而与上述变体的变异前的氨基酸序列不同，但维持了功能(functions)或特性(properties)。在这里，“保守性置换”是指将一个氨基酸置换为结构和/或化学性质相似的其它氨基酸，对蛋白质或多肽的活性几乎不产生影响，或者可以完全不产生影响。此外，变体包括一个以上的n-末端前导序列或跨膜结构域(transmembrane domain)之类的部分被剔除的变体、或者一部分从成熟蛋白质(matureprotein)的n-和/或c-末端被剔除的变体。与变异前的多肽相比，这样的变体其能力可以增加或不变或减少。在本发明中，变体可以与变异型、改变、变异型多肽、变异的蛋白质、变异等混用。

16、本发明中的变体是铵运输蛋白变体，是位于seq id no:3的氨基酸序列中的第363号的氨基酸即甘氨酸被置换为天冬氨酸而成的，可以由seq id no:1的氨基酸序列组成。

17、另外，本发明中的变体是腺嘌呤运输蛋白变体是位于seq id no:7的氨基酸序列中的第136号的氨基酸即色氨酸被置换为终止密码子而成的，可以由seq id no:5的氨基酸序列组成。

18、另外，本发明中的变体是fmn/fad运输蛋白变体，是位于seq id no:11的氨基酸序列中的第272号的氨基酸即甘氨酸被置换为谷氨酰胺而成的，可以由seq id no:9的氨基酸序列组成。

19、本发明的另一方式提供编码上述铵运输蛋白变体、腺嘌呤运输蛋白变体或fmn/fad运输蛋白变体的多核苷酸。

20、本发明中所使用的“多核苷酸(polynucleotide)”是核苷酸单体(monomer)通过共价键以链状长长地连接而成的核苷酸的聚合物(polymer)，是一定长度以上的dna或rna链，更具体而言，是指编码上述变体的多核苷酸片段。

21、上述多核苷酸可以包含编码seq id no:1、5或9的氨基酸序列的碱基序列。

22、根据本发明的一具体例，上述多核苷酸可以包含由seq id no:2、6或10表示的碱基序列。

23、更具体而言，编码上述铵运输蛋白变体的多核苷酸包含由seq id no:2表示的碱基序列，编码上述腺嘌呤运输蛋白变体的多核苷酸包含由seq id no:6表示的碱基序列，编码上述fmn/fad运输蛋白变体的多核苷酸包含由seq id no:10表示的碱基序列。

24、本发明的另一方式提供包含编码上述铵运输蛋白变体、腺嘌呤运输蛋白变体或fmn/fad运输蛋白变体的多核苷酸的载体。

25、另外，本发明的另一方式提供包含上述铵运输蛋白变体、腺嘌呤运输蛋白变体或fmn/fad运输蛋白变体、或它们的多核苷酸的转化体。

26、本发明中所使用的“载体(vector)”是指作为用于向宿主细胞传递、表达目标基因的手段所使用的所有类型的核酸序列转运结构体。除非另有说明，否则上述载体可以是指使担载的核酸序列插入宿主细胞基因内进行表达和/或独立进行表达。这样的载体为了表达基因插入物而包括可操作地连接的必需的调控元件，“可操作地连接的(operablylinked)”是指目标基因与其调控序列彼此功能性地结合并以能够进行基因表达的方式连接，“调控元件”包括用于实施转录的启动子、用于调控转录的任意的操纵子序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列、以及调控转录和翻译的终止的序列。

27、本发明中所使用的载体只要能够在宿主细胞中进行复制就没有特别限定，可以利用该领域中已知的任意的载体。作为上述载体的一个例子，可以举出天然状态或重组状态的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，有pwe15、m13、λmbl3、λmbl4、λixii、λashii、λapii、λt10、λt11、charon4a、charon21a等，作为质粒载体，有pbr系、puc系、pbluescriptii系、pgem系、ptz系、pcl系和pet系等，但并不限定于此。

28、上述载体可以代表性地构建为用于克隆的载体或用于表达的载体。用于表达的载体可以使用该领域中用于在植物、动物或微生物中表达外源基因或蛋白质的常规载体，并且可以通过该领域中公知的各种方法而构建。

29、重组载体可以以原核细胞或真核细胞为宿主进行构建。例如，在所使用的载体为表达载体且以原核细胞为宿主时，可以使转录进行的强启动子(例如，plλ启动子、cmv启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、t7启动子)通常包含用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。在以真核细胞为宿主时，在载体所包含的真核细胞中启动的复制起点包括f1复制起点、sv40复制起点、pmb1复制起点、腺病毒复制起点、aav复制起点和bbv复制起点等，但并不限定于此。此外，可以利用源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或者源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒启动子、hsv的tk启动子)，并且通常具有多聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。

30、上述重组载体可以包括选择标记(selection marker)，上述选择标记用于选择利用载体转化的转化体(宿主细胞)，在经上述选择标记处理的培养基中只有表达选择标记的细胞可以生存，因此能够选择转化的细胞。作为代表性的例子，上述选择标记有卡那霉素、链霉素、氯霉素等，但并不限定于此。

31、通过将重组载体插入宿主细胞，从而可以制作转化体，上述转化体可以通过将重组载体导入合适的宿主细胞而得到。宿主细胞是可以稳定且连续地克隆或表达上述表达载体的细胞，也可以利用该领域中公知的任何宿主细胞。

32、在为了制作重组微生物而对原核细胞进行转化时，作为宿主细胞，可以利用e.coli jm109、e.coli bl21、e.coli rr1、e.coli le392、e.coli b、e.coli x 1776、e.coli w3110、e.coli xl1-blue之类的大肠杆菌属菌株；枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌之类的芽孢杆菌属菌株；鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌和假单胞菌种之类的各种肠道细菌和菌株等，但并不限定于此。

33、在为了制作重组微生物而对真核细胞进行转化时，作为宿主细胞，可以利用酵母(例如，酿酒酵母)、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞，例如，sp2/0、cho k1、cho dg44、per.c6、w138、bhk、cos7、293、hepg2、huh7、3t3、rin、mdck细胞株等，但并不限定于此。

34、本发明中所使用的“转化(transformation)”是指将外源dna导入宿主细胞内而人为引起基因改变的现象，“转化体(transformat)”是指导入有外源dna并稳定维持目标基因的表达的宿主细胞。

35、在上述转化中，根据宿主细胞而选择合适的载体导入技术，从而可以在宿主细胞内表达目标基因或包含其的重组载体。例如，载体导入可以通过电穿孔法(electroporation)、热冲击(heat-shock)、磷酸钙(capo4)沉淀、氯化钙(cacl2)沉淀、显微注射法(microinjection)、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、阳离子脂质体法、乙酸锂-dmso法、或者它们的组合而实施，但并不限定于此。转化的基因只要可以在宿主细胞内表达，就可以被包括在内，而不限制于将其插入宿主细胞的染色体内或者位于染色体外。

36、上述转化体包括在生物体内或试管内利用根据本发明的重组载体转染、转化或感染的细胞，并且可以与重组宿主细胞、重组细胞或重组微生物作为相同的用语被使用。

37、根据本发明的一具体例，上述转化体可以为埃希菌(escherichia)属菌株。

38、上述埃希菌属菌株，有大肠埃希菌(escherichia coli)、艾伯特埃希菌(escherichia albertii)、蟑螂埃希菌(escherichia blattae)、弗格森埃希菌(escherichia fergusonii)、赫氏埃希菌(escherichia hermannii)、伤口埃希菌(escherichia vulneris)等，但并不限定于此。

39、本发明中的转化体可以为包含上述运输蛋白变体或对其进行编码的多核苷酸的菌株、或者包含含有其的载体的菌株；表达上述运输蛋白变体或多核苷酸的菌株；或者具有对上述运输蛋白变体的活性的菌株，但并不限定于此。

40、根据本发明的一具体例，上述转化体可以具有l-芳香族氨基酸生产能力。

41、上述转化体可以在自然下具有l-芳香族氨基酸生产能力，或者可以在人为下被赋予l-芳香族氨基酸生产能力。

42、根据本发明的一具体例，上述转化体由于铵运输蛋白变体、腺嘌呤运输蛋白变体或fmn/fad运输蛋白的活性得到改变，因此l-芳香族氨基酸生产能力可以得到提高。

43、本发明中所使用的“生产能力得到提高”是指与亲本菌株相比，l-芳香族氨基酸的生产率增加。上述亲本菌株是指成为变异对象的野生型或变异株，包括直接成为变异的对象或通过重组的载体等转化的对象。在本发明中，亲本菌株可以是野生型埃希菌属菌株或由野生型变异的埃希菌属菌株。

44、根据本发明的转化体通过导入铵运输蛋白变体、腺嘌呤运输蛋白变体或fmn/fad运输蛋白变体，从而各运输蛋白的活性改变，显示出与亲本菌株相比增加的l-芳香族氨基酸生产能力，特别是，与亲本菌株相比，l-芳香族氨基酸生产量增加10％以上，具体而言，增加10至80％(优选15至60％)，每1l的菌株培养液可以生产3.5～20g的l-芳香族氨基酸。

45、本发明的另一方式提供l-芳香族氨基酸的生产方法，其包括以下步骤：在培养基中培养上述转化体的步骤；以及从上述转化体或培养转化体的培养基中回收l-芳香族氨基酸的步骤。

46、上述培养可以根据该领域中已知的合适的培养基和培养条件而进行，只要是本领域技术人员就可以容易地调整培养基和培养条件来使用。具体而言，上述培养基可以是液体培养基，但并不限定于此。培养方法可以包括例如分批式培养(batch culture)、连续式培养(continuous culture)、补料分批式培养(fed-batch culture)或者它们的组合培养，但并不限定于此。

47、根据本发明的一具体例，上述培养基必须以合适的方式满足特定菌株的要求，可以由本领域技术人员适当地进行变形。关于埃希菌属菌株的培养基，可以参考公知的文献(manual of methods for general bacteriology.american society forbacteriology.washington d.c.,usa,1981)，但并不限定于此。

48、根据本发明的一具体例，培养基中可以包含各种碳源、氮源和微量元素成分。作为可以使用的碳源，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素之类的糖及碳水化合物；大豆油、葵花籽油、蓖麻籽油、椰子油等油及脂肪；棕榈酸、硬脂酸、亚油酸之类的脂肪酸；甘油、乙醇之类的醇；乙酸之类的有机酸。这些物质可以单独使用或以混合物的形式使用，但并不限定于此。作为可以使用的氮源，可以包括蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆、豆粕和尿素或者无机化合物，例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源同样可以单独使用或以混合物的形式使用，但并不限定于此。作为可以使用的磷的供应源，可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠的盐，但并不限定于此。此外，培养基可以含有生长所需要的硫酸镁或硫酸铁之类的金属盐，但并不限定于此。除此以外，可以包含氨基酸和维生素之类的必要生长物质。此外，可以使用适合培养基的前体。上述培养基或单个成分可以在培养过程中通过适当的方式分批或连续添加到培养液中，但并不限定于此。

49、根据本发明的一具体例，在培养过程中，可以将氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸之类的化合物以适当的方式添加到微生物培养液中来调整培养液的ph。此外，在培养过程中，可以使用脂肪酸聚乙二醇酯之类的消泡剂来抑制气泡产生。进一步而言，为了维持培养液的有氧状态，可以向培养液内注入氧气或者含氧气的气体(例如空气)。培养液的温度通常可以为20℃至45℃，例如，可以为25℃至40℃。培养时间可以持续到有用物质获得期望的生产量为止，例如，可以为10至160小时。

50、根据本发明的一具体例，在从上述培养的转化体或培养转化体的培养基中回收l-芳香族氨基酸的步骤中，可以根据培养方法并利用该领域中公知的合适的方法，从培养基中收集或回收所生产的l-芳香族氨基酸。例如，可以使用离心分离、过滤、提取、喷雾、干燥、蒸发、沉淀、结晶化、电泳、分级溶解(例如，硫酸铵沉淀)、色谱法(例如，离子交换、亲和性、疏水性和尺寸排阻)等方法，但并不限定于此。

51、根据本发明的一具体例，在上述回收l-芳香族氨基酸的步骤中，可以将培养基低速离心分离而去除生物质，可以将得到的上清液通过离子交换色谱法而分离。

52、根据本发明的一具体例，在上述回收l-芳香族氨基酸的步骤中，可以包括纯化l-芳香族氨基酸的工序。

53、根据本发明的一具体例，上述l-芳香族氨基酸可以为选自l-色氨酸、l-苯丙氨酸和l-酪氨酸中的1种以上。

54、根据本发明的运输蛋白变体通过置换构成铵运输蛋白、腺嘌呤运输蛋白或fmn/fad运输蛋白的氨基酸序列中的一个以上的氨基酸来改变蛋白质活性，从而包含其的重组微生物可以有效地生产l-芳香族氨基酸。