本发明属于生物，更具体的是，本发明涉及一种联产单细胞蛋白及柠檬酸的方法。
背景技术：
1、柠檬酸(citric acid)，又称枸椽酸，是一种三元羧酸，其学名为3-羟基-3-羧基戊二酸，分子式c6h8o7(无水物)，在自然界中存在于柠檬、柑桔、梅、李子、梨、桃、无花果等水果中。柠檬酸具有令人愉悦的酸味，入口爽快，无后酸味，安全无毒，被广泛用作食品和饮料的酸味剂，因此被广泛用于食品饮料、医药化工、清洗与化装品、有机材料等领域，是目前世界需求量最大的一种有机酸，到目前还没有一种可以取代柠檬酸的酸味剂。
2、1784年c.w.舍勒首先从柑橘中提取柠檬酸。他是通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的。天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州、意大利和西印度群岛。意大利的产量居首位。到1922年，世界柠檬酸的总销售额的90％由美国、英国、法国等垄断。发酵法制取柠檬酸始于19世纪末。1893年c.韦默尔发现青霉(属)菌能积累柠檬酸。
3、1950年前，柠檬酸采用浅盘发酵法生产。1952年国迈尔斯试验室采用深层发酵法大规模生产柠檬酸。此后，深层发酵法逐渐建立起来。深层发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化，现已成为柠檬酸生产的主要方法。
4、微生物蛋白作为一种高品质蛋白质的替代来源，目前也逐渐用于食品生产。微生物蛋白自身具有较高的营养价值，富含人体所需的多种氨基酸、维生素，多糖含量也较丰富，同时一些菌种及其发酵代谢产物已被长期用于食品生产和加工，例如酵母菌及其发酵产物可以直接添加到其他食品中，用于天然调味物质和鲜味物质，增强食品的滋味和香味。
5、研究表明，微生物蛋白含有丰富的蛋白质及多种维生素和无机盐，是一种营养较为全面的理想蛋白质来源，将其掺入面条、饼干、饮料、乳制品中，可以提高这些传统食品的营养价值。微生物蛋白还常作为食品添加剂，用以补充蛋白质、dha、维生素、矿物质等。螺旋藻被广泛应用于膳食补充剂以及食品中蛋白质的来源，其蛋白质含量高达40％-60％，含有多种人体必需氨基酸及其他营养成分。
6、解脂耶氏酵母可产生柠檬酸和异柠檬酸的混合物，其比例主要取决于所使用的碳源，而且解脂耶氏酵母也可生产单细胞蛋白，其生成的单细胞蛋白积累在菌体内部，而合成的柠檬酸分泌到菌体外，游离在发酵液中，两者在空间上互不干扰，找出一种适合同时生成单细胞蛋白及柠檬酸的工艺，可以更有效的利用资源，具有十分重要的意义。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种联产单细胞蛋白及柠檬酸的工艺。现有技术中，利用解脂耶氏酵母生产单细胞蛋白和柠檬酸都是分开的，独立的，没有联产单细胞蛋白及柠檬酸的工艺，而且各自产量都不高。本发明通过解脂耶氏酵母在特定生长过程中进行适合的调节方式，控制碳氮比，激活相应代谢途径的表达，使解脂耶氏酵母高效生产单细胞蛋白的同时合成柠檬酸。通过本发明的实施，合成单细胞蛋白的浓度可以达到140g/l，粗蛋白含量达到46％，同时合成柠檬酸的浓度可以达到96g/l，副产物异柠檬酸占比2％。本发明的工艺简单高效，可以同时获得高产量的微生物单细胞蛋白产品(2.8g/l/h)及柠檬酸(1.92g/l/h)。
2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
3、一种联产单细胞蛋白及柠檬酸的方法，所述方法包括：将解脂耶氏酵母菌种接种于种子培养基中进行种子培养，得到一级种子液、二级种子液；将所述二级种子液接种于发酵罐培养基中进行发酵，所述发酵罐发酵的过程中补加碳源、氮源和分段调控，并控制不同阶段的碳氮比，实现联产单细胞蛋白及柠檬酸。
4、优选地，所述种子培养包括依次进行的一级种子培养和二级种子培养。
5、优选地，所述种子培养所用的一级、二级种子培养基包括如下重量百分比的组分：酵母粉7-9％，酪蛋白胨3-8％，乙酸钠0.8-1.3％，蔗糖1.2-2.6％，用盐酸或氨水调节ph为4-7。优选地，所述一级/二级种子培养基中的余量为水。
6、一些具体的实施方案中，所述方法包括：
7、(1).取解脂耶氏酵母菌种，接种到一级种子培养基中，接种量是0.2％-0.5％，培养菌种生长，菌体od生长到3-5，得到一级种子液。
8、(2).将一级种子液接种到二级种子培养基中，接种量是3％-8％，生长，菌体od生长到8-15，得到二级种子液。
9、(3).将二级种子液接种到发酵罐中，接种量是4％-10％，设定发酵罐的初始条件进行发酵。
10、优选地，所述发酵罐培养基包括三种组分，按照质量百分比配制，除溶质外，其余为水。组分1为：酵母粉10-15％，酪蛋白胨8-12％，乙酸钠1.2-2％，大豆油0.8-1.5％，硫酸铵3.8-5.4％，磷酸二氢钾3-5％，磷酸氢二钠2-4％；组分2：硫酸锰0.01-0.018％，硫辛酸0.08-0.22％，肌醇0.002-0.01％，泛酸0.005-0.01％，维生素b6 0.04-0.18％；组分3：橄榄油0.6-1％，甘油2-3.5％。三种组分单独分开灭菌，灭菌后三者按照质量比(2-4):(1-3):1混合泵入到发酵罐中。
11、发酵罐的初始条件是搅拌转速180-220转/分钟，通气量0.6-1.8vvm，温度28-32℃，ph4-6；
12、随着菌体发酵生长，消耗氧气的速度会越来越快，溶氧会不断下降，通过调节转速及通气量，控制溶氧在15％以上；
13、当发酵液菌体湿重达到100g/l时，进行补加碳源和氮源，碳源的补料速率为每分钟补加发酵液质量比的0.04-0.08％。设定碳氮比为100-120:1，根据碳氮比调节氮源的流加速度；
14、作为本发明的优选技术方案，所述碳源为橄榄油与甘油的组合，质量比为(1.5-5):1，所述氮源包括尿素、硫酸铵、硝酸铵、氨水中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选30-35wt％硫酸铵，优选地，所述硫酸铵以硫酸铵水溶液的形式进行补加；
15、当发酵液菌体湿重达到380g/l时，调整碳氮比180-210:1，碳源速度不变，根据碳氮比调节氮源的流加速度。
16、作为本发明的优选技术方案，通过对发酵不同时期的过程调控，包括碳氮比、溶氧和通气量的调控，调节菌体生长环境到达菌体的最佳生长条件单细胞蛋白合成的最佳状态和柠檬酸合成最大速率。
17、(4).当菌体湿重不再增加，即可停止发酵，将发酵液经后处理，得到单细胞蛋白和柠檬酸。
18、优选地，所述后处理的方法包括：所述发酵得到的发酵液依次进行固液分离、洗涤和干燥，得到所述单细胞蛋白；
19、优选地，所述固液分离的方法为离心分离，所述洗涤的洗涤剂为水，所述干燥的方法包括喷雾干燥；优选的喷雾干燥条件为：进风温度140-160℃，频率为200-220赫兹，进料速度为1.8-3.2l/小时；
20、例如，将发酵液经8000-10000转/每分钟，20-30分钟离心后得到上清液和菌体沉淀；其中，菌体沉淀经过重悬离心清洗后，进行喷雾干燥，收集喷雾干燥粉末即得到单细胞蛋白产品；
21、上清液加入过量碳酸钙孵育，形成柠檬酸钙，再加入硫酸置换，经过离子交换去除钙离子、铁离子、硫酸根，活性炭脱色，蒸发结晶后得到柠檬酸成品。
22、需要说明的是，术语“接种量”是指移入的种子液质量与接种后培养体系质量的比例。示例性地，接种量为5％即种子液的质量分数为5％。下文中涉及“接种量”描述时，均指代质量分数，简明起见，不再逐一赘述。
23、本发明的有益效果在于：
24、本发明提供的联和生产单细胞蛋白及柠檬酸的方法，包括适配培养基组成、特定补料方式、碳氮比的范围以及过程中分步过程调控策略，实现富含单细胞菌体的快速生长和柠檬酸的快速合成，与现有的分别生产单细胞蛋白和柠檬酸时长相比缩短至1/3，同时单细胞蛋白的干重浓度可以达到140g/l以上，生产速度为2.8g/(l·h)，相比同类型的产量可提高约10倍；粗蛋白含量≥46％，相比于现有技术的可提升30％；合成柠檬酸的浓度可以达到96g/l以上，副产物异柠檬酸占比2％，生产速度为1.92g/(l·h)，从而显著提升了生产单细胞蛋白及柠檬酸的浓度和生产速度。