一种神经母细胞瘤原代细胞的培养基及培养方法和应用与流程

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种神经母细胞瘤原代细胞的培养基及培养方法和应用。

背景技术：

1、神经母细胞瘤占儿童肿瘤的第三位，是威胁儿童生命的主要恶性肿瘤。90％的患者诊断时小于5岁，发病平均年龄为19个月。神经母细胞瘤的早期诊断难、恶性程度高、转移速度快，常规治疗方法的5年生存率仅为10～20％。几乎占全部儿童癌症死亡的15％。因此，神经母细胞瘤被称为“儿童肿瘤之王”。

2、神经母细胞瘤通常可以通过尿儿茶酚胺和影像学检查来确诊。然而，为了确立生物学(即细胞遗传学，病理学)和危险分层，需要对原发部位(或用于分期的骨髓)进行活检。治疗主要取决于风险分级，从对某些低危患者仅进行观察，到对于高危患者进行强化多模式疗法，治疗方式各不相同。对于低危疾病患者，预后良好，而对于高危疾病患者，预后较差。复发或难治性(高危)疾病难以治愈，并且生存率极低。

3、因此，在体外建立原代肿瘤模型，并利用它进行高效的药物筛选实验是一个有良好前景的方案。目前，建立原代神经母细胞瘤体外培养模型的主要方法有人源肿瘤异种移植模型(patient-derived tumor xenograft，pdx)，该方法是将患者的肿瘤细胞移植到裸鼠体内，再考察不用抗肿瘤药物对其的治疗效果。然而，pdx方法也有一些不足，例如：人与鼠之间的物种差异；测试周期长(4周以上)；成本高(20万以上)；容易出现假阳性与假阴性。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于在体外快速扩增神经母细胞瘤原代细胞的培养基及培养方法和应用，本发明方法无需异种移植，只需在使用时将神经母细胞瘤原代细胞种入培养基中即可；采用本发明培养基及培养方法，可避免异种移植的物种差异，还同时具有扩增效率高、培养成本可控、成功率高、不存在假阳性与假阴性的优点。

2、本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

3、一种神经母细胞瘤原代细胞的培养基，包括如下组成成分：初始培养基，mst1/2激酶抑制剂，胎牛血清，y-27632，胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂，胰岛素，胰岛素样生长因子-1，成纤维细胞生长因子7，胃泌素，肝细胞生长因子；

4、所述初始培养基选自dmem/f12、dmem、f12或rpmi-1640；

5、所述mst1/2激酶抑制剂在培养基中的含量为2.5～10μm；

6、所述胎牛血清相对培养基的体积百分比含量为2.5％～40％；

7、所述y-27632在培养基中的含量为2.5～20μm；

8、所述胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂相对培养基的体积比含量为1：25～1：400；

9、所述胰岛素在培养基中的含量为2.5～40μg/ml；

10、所述胰岛素样生长因子-1在培养基中的含量为12.5～200ng/ml；

11、所述成纤维细胞生长因子7在培养基中的含量为2.5～40ng/ml；

12、所述胃泌素在培养基中的含量为1～81nm；

13、所述肝细胞生长因子在培养基中的含量为1～81ng/ml。

14、作为本发明的优选方式之一，所述mst1/2激酶抑制剂包括式(i)化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物；

15、

16、式中，r1选自c1～c6烷基、c3～c6环烷基、c4～c8环烷基烷基、c2～c6螺环烷基、以及任选地被1～2个独立地r6取代的芳基(例如苯基和萘基等)、芳基c1～c6烷基(例如苯甲基等)和杂芳基(例如噻吩基等)；

17、r2和r3各自独立地选自c1～c6烷基；

18、r4和r5各自独立地选自氢、c1～c6烷基、c3～c6环烷基、c4～c8环烷基烷基、c1～c6烷基羟基、c1～c6卤代烷基、c1～c6烷基氨基c1～c6烷基、c1～c6烷氧基c1～c6烷基和c3～c6杂环基c1～c6烷基(所述杂环基选自例如哌啶基、四氢吡喃基等)；

19、r6选自卤素、c1～c6烷基、c1～c6烷氧基和c1～c6卤代烷基。

20、具体地，所述式(i)的化合物中：

21、r1选自c1～c6烷基、c3～c6环烷基、c4～c8环烷基烷基、c2～c6螺环烷基、以及任选地被1～2个独立地r6取代的苯基、萘基、苯甲基和噻吩基；

22、r2和r3各自独立地选自c1～c3烷基；

23、r4和r5各自独立地选自氢、c1～c6烷基、c3～c6环烷基、c4～c8环烷基烷基、c1～c6烷基羟基、c1～c6卤代烷基、c1～c6烷基氨基c1～c6烷基、c1～c6烷氧基c1～c6烷基、哌啶基c1～c6烷基和四氢吡喃基c1～c6烷基；

24、r6选自卤素(优选氟和氯，更优选氟)、c1～c6烷基(优选甲基)、c1～c6烷氧基(优选甲氧基)和c1～c6卤代烷基(优选三氟甲基)。

25、作为本发明的优选方式之一，所述mst1/2激酶抑制剂包括式(ia)化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物；

26、

27、式中，r1选自c1～c6烷基、任选地被1～2个独立地r6取代的苯基、任选地被1～2个独立地r6取代的噻吩基、和任选地被1～2个独立地r6取代的苯甲基；

28、r5选自氢、c1～c6烷基和c3～c6环烷基；

29、r6各自独立地选自卤素、c1～c6烷基和c1～c6卤代烷基。

30、具体地，所述式(ia)的化合物中：

31、r1为任选地被1～2个独立地r6取代的苯基；

32、r5为氢；

33、r6为氟、甲基或三氟甲基。

34、作为本发明的优选方式之一，所述mst1/2激酶抑制剂选自表1中化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物中的至少一种。

35、表1本发明mst1/2激酶抑制剂化合物列表

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40、

41、

42、其中，化合物1为最优mst1/2激酶抑制剂。

43、作为本发明的优选方式之一，还包括n2细胞培养添加剂；所述n2细胞培养添加剂在培养基中的体积比含量为1：25～1：400。

44、作为本发明的优选方式之一，还包括抗生素；所述抗生素选自链霉素、青霉素、两性霉素b和primocin中的一种或多种；当抗生素选择链霉素时，添加浓度为25～400μg/ml；当抗生素选择青霉素时，添加浓度为25～400u/ml；当抗生素选择两性霉素b时，添加浓度为0.25～4μg/ml；当抗生素选择primocin时，添加浓度为25～400μg/ml。

45、一种神经母细胞瘤原代细胞培养方法，使用上述神经母细胞瘤原代细胞的培养基对神经母细胞瘤原代细胞进行培养。

46、作为本发明的优选方式之一，包括如下步骤：

47、(1)配制上述神经母细胞瘤原代细胞的培养基；

48、(2)将神经母细胞瘤原代细胞按照细胞密度1～10×104个/cm2种入培养皿中，然后使用所述神经母细胞瘤原代细胞的培养基进行培养。

49、一种上述神经母细胞瘤原代细胞的培养基在体外快速扩增神经母细胞瘤原代细胞上的应用，即使用本发明神经母细胞瘤原代细胞培养基对神经母细胞瘤原代细胞进行体外快速扩增培养。

50、本发明相比现有技术的优点在于：

51、(1)无需异种移植，只需在使用时将神经母细胞瘤原代细胞种入培养基中即可实现神经母细胞瘤原代细胞的体外快速扩增培养，可避免异种移植的物种差异；

52、(2)扩增效率高：只要有105级别的细胞数量就可在1～2周左右时间内成功扩增出106数量级的神经母细胞瘤原代细胞，扩增出的神经母细胞瘤原代细胞还可以连续传代；

53、(3)成功率高：能够培养神经母细胞瘤(最常见的类型)、节细胞神经母细胞瘤和节细胞神经瘤等多样本源的肿瘤组织，成功率达到80％以上；

54、(4)培养成本可控：培养基无需加入价格昂贵的wnt激动剂、r-spondin家族蛋白、bmp抑制剂、fgf10等因子；

55、(5)不存在假阳性与假阴性：体外原代培养的神经母细胞瘤原代细胞，能够保持病人的病理特性，且所培养的原代神经母细胞瘤细胞不受成纤维细胞、脂肪细胞等间质细胞的干扰；

56、(6)所述技术培养获得的神经母细胞瘤原代细胞数量大，均一化程度高，适合高通量筛选新候选化合物和为病人提供高通量药物体外敏感性功能测试。