一种使用混菌结合载体法验证消毒剂消毒效力的方法与流程

本发明涉及消毒杀菌，尤其涉及一种使用混菌结合载体法验证消毒剂消毒效力的方法。

背景技术：

1、消毒是药物等医疗制剂制备的关键环节，是清除微生物的主要手段。以药物生产车间为例，车间的地面、桌面、墙面、设备表面、操作台、工器具等均需要进行杀菌消毒，且符合预定的要求后才能进行正常生产。为保证消毒的有效性和彻底性，需要对消毒剂的消毒效果进行验证。

2、现有消毒剂的效力验证通常依据消毒技术规范给定的方法进行。然而，药物生产车间洁净区使用的消毒剂通常有3-5种，根据消毒技术规范要求每种消毒剂需要对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌及环境菌等多种微生物进行消毒效力验证，采用每种微生物单独测试，3-5种消毒剂对7-10种微生物的消毒效力验证需要进行上千组实验，导致验证工作量大，操作不方便，项目时长一般需要半年以上，严重限制了消毒效力验证方法的应用。因此亟需开发一种更高效的消毒效力检测方法。

技术实现思路

1、本发明提供一种使用混菌结合载体法验证消毒剂消毒效力的方法。

2、为解决现有消毒效力检测方法存在的工作量大、周期长、效率低的问题，本发明提出了将用于效力验证的微生物进行分组，并将同一组微生物进行混合培养和消毒效力验证的方法，该方法打破了现有的采用消毒剂单独对每一种微生物进行培养和消毒效力验证的惯例，突破性地采用一种消毒剂同时作用于多种微生物，显著提高了工作效率，解决了验证工作量大(至少可减少50％的工作量)，项目时间长的问题，且该方法得到的消毒效力验证结果具有较高的准确性。

3、具体地，本发明提供以下技术方案：

4、本发明提供一种消毒效力检测方法，所述方法包括：将用于消毒效力检测的微生物进行分组，将各组内的微生物混合进行消毒效力检测；

5、其中，所述微生物包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉和枯草杆菌黑色变种芽孢；

6、所述分组为将所述微生物分为以下三组：1)包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌；2)包括白色念珠菌和黑曲霉；3)包括枯草杆菌黑色变种芽孢。

7、本发明对上述微生物的分组方式进行了大量的尝试并发现，按照上述分组方式不仅能够保证各组中不同微生物在混合培养过程中不会产生相互抑制，而且在消毒剂处理时各组中不同微生物之间也不会产生相互干扰，既能够保证混合培养中各种微生物的正常生长，也能够较好地保证消毒效力验证结果的可靠性。

8、本发明所述的微生物还可包括其他环境微生物，包括但不限于溶血性葡萄球菌、藤黄微球菌、科氏葡萄球菌、除枯草杆菌黑色变种芽孢以外的其他环境芽孢中的一种或多种。

9、不同生产车间等不同环境中的环境微生物不同，通常为溶血性葡萄球菌、藤黄微球菌、科氏葡萄球中的一种，也有同时存在2种或3种的情况，因此根据环境菌株的辨别度等可将其单独或者分为一组进行消毒效力检测。

10、上述方法中，所述消毒效力检测包括：利用待检测的消毒剂分别处理金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的混合菌悬液、白色念珠菌和黑曲霉的混合菌悬液以及枯草杆菌黑色变种芽孢菌悬液，再将消毒剂处理后的菌悬液分别进行中和并将中和产物进行培养，培养结束后分别对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草杆菌黑色变种芽孢的菌落进行计数。

11、上述金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的混合菌悬液即为金黄色葡萄球菌的菌悬液、大肠埃希菌的菌悬液和铜绿假单胞菌的菌悬液的混合物，白色念珠菌和黑曲霉的混合菌悬液即为白色念珠菌的菌悬液和黑曲霉的菌悬液的混合物。

12、优选地，在消毒剂作用结束后，采用中和剂进行中和，然后再进行菌悬液的培养。

13、优选地，用无菌生理盐水代替消毒剂处理，作为阳性对照，根据待检测消毒剂和阳性对照的菌落计数结果，计算微生物杀灭对数值kl。

14、优选地，将消毒剂处理后的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的混合菌悬液经中和后在胰酪大豆胨琼脂培养基中进行混合培养。采用胰酪大豆胨琼脂培养基进行金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的混合培养可以保证上述各种微生物均能够正常生长，进而保证消毒效力检测结果的可靠性。

15、将消毒剂处理后的白色念珠菌和黑曲霉的混合菌悬液经中和后在沙氏葡萄糖琼脂培养基中进行混合培养。采用沙氏葡萄糖琼脂培养基进行白色念珠菌和黑曲霉的混合培养可以保证上述各种微生物均能够正常生长，进而保证消毒效力检测结果的可靠性。

16、将消毒剂处理后的枯草杆菌黑色变种芽孢菌悬液经中和后在胰酪大豆胨琼脂培养基中进行培养。

17、优选地，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的混合培养温度为30～35℃。

18、白色念珠菌和黑曲霉的混合培养温度为20～25℃。

19、枯草杆菌黑色变种芽孢的培养温度为30～35℃。

20、优选地，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的混合培养时间为2-3天。

21、白色念珠菌和黑曲霉的混合培养时间为3-5天。

22、枯草杆菌黑色变种芽孢的培养时间为2-3天。

23、上述方法中，根据菌落计数结果判断待检测消毒剂对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉和枯草杆菌黑色变种芽孢的消毒效力。

24、上述方法中，所述消毒效力检测优选使用悬液法或载体法。

25、悬液法或载体法的具体操作可参考消毒技术规范、消毒剂实验室杀菌效果检验方法等。

26、具体地，所述悬液法包括：将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的混合菌悬液、白色念珠菌和黑曲霉的混合菌悬液以及枯草杆菌黑色变种芽孢菌悬液分别与待检测的消毒剂接触，作用结束后进行中和，将中和产物进行培养。

27、所述载体法包括：将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的混合菌悬液、白色念珠菌和黑曲霉的混合菌悬液以及枯草杆菌黑色变种芽孢的菌悬液分别均匀覆盖在载体上制得菌片，将待检测的消毒剂作用于所述菌片，作用结束后进行中和，将中和产物进行培养。

28、优选地，将待检测的消毒剂作用于所述菌片为：将所述消毒剂均匀喷雾于菌片表面，或者利用所述消毒剂浸泡或擦拭菌片。

29、优选地，所述作用的时间为0.5-30min，由消毒剂的特性决定。

30、优选地，所述中和使用的中和剂包括如下组分：0.2-0.4％(w/v)卵磷脂，1-3％(w/v)吐温80，4-6％(w/v)硫代硫酸钠。所述中和的时间为5-15min。

31、上述方法中，将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌分别进行培养，将各微生物的菌悬液混合得到金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的混合菌悬液；将白色念珠菌、黑曲霉分别进行培养，将各微生物的菌悬液混合得到白色念珠菌和黑曲霉的混合菌悬液；将枯草杆菌黑色变种芽孢进行培养，得到枯草杆菌黑色变种芽孢菌悬液。

32、优选地，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌混合的活菌数比例为107-108cfu/ml：107-108cfu/ml：107-108cfu/ml；

33、白色念珠菌和黑曲霉混合的活菌数比例为106-107cfu/ml：106-107cfu/ml。

34、优选地，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的培养使用的培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基。

35、白色念珠菌、黑曲霉的培养使用的培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基；

36、枯草杆菌黑色变种芽孢的培养使用的培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基。

37、本发明对于消毒剂的种类没有特殊限制，可为任意消毒剂，优选为75％乙醇或杀孢子剂。

38、本发明的有益效果至少包括：本发明提供的消毒效力检测方法显著提高了消毒剂消毒效力检测的工作效率，至少可减少50％的工作量，解决了现有方法存在的工作量大、项目时间长、效率低的问题；同时，该方法得到的消毒效力验证结果具有较高的准确性，在消毒剂的消毒效力验证、消毒剂筛选中具有较好的应用前景。