肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途的制作方法

本发明提供了来自肺炎链球菌血清型23a和23b的纯化的荚膜多糖，以及具有来自一种或多种这些血清型的多糖的多糖-蛋白缀合物。来自一种或多种这些血清型的多糖-蛋白缀合物可以包含在多价肺炎球菌缀合物疫苗中。

背景技术：

1、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)是一种荚膜细菌，并且是全世界严重疾病的重要原因。1997年，美国疾病控制与预防中心(cdc)估计，美国每年有3,000例肺炎球菌脑膜炎、50,000例肺炎球菌菌血症、7,000,000例肺炎球菌中耳炎和500,000例肺炎球菌性肺炎。参见centers for disease control and prevention,mmwr morb mortal wkly rep1997,46(rr-8):1-13。此外，这些疾病的并发症可能很严重，一些研究报道，肺炎球菌脑膜炎的死亡率高达8％，神经系统后遗症高达25％。参见arditi等,1998,pediatrics 102:1087-97。

2、事实证明，已获许可多年的多价肺炎球菌多糖疫苗在预防成年人，尤其是老年人和高危人群的肺炎球菌疾病方面具有不可估量的价值。然而，婴幼儿对未缀合的肺炎球菌多糖反应较差。细菌多糖是不依赖t细胞的免疫原，在婴儿中引起微弱反应或无反应。细菌多糖免疫原与载体蛋白的化学缀合可将婴儿的免疫应答转化为一种依赖t细胞的免疫应答。白喉类毒素(dtx，dt的化学去毒版本)和crm197被描述为细菌多糖免疫原的载体蛋白，因为它们的氨基酸序列中存在刺激t细胞的表位。

3、肺炎球菌缀合物疫苗于2000年2月首次在美国获得许可，其含有当时在婴幼儿中引起侵袭性肺炎球菌疾病的7种最常见的血清型(4，6b，9v，14，18c，19f和23f)。在美国普遍使用后，由于中存在的血清型，儿童的侵袭性肺炎球菌疾病已显著减少。参见centers for disease control and prevention,mmwr morbmortal wkly rep 2005,54(36):893-7。但是，在世界某些地区，的血清型覆盖受限，并且在美国存在某些新兴血清型的证据(例如19a等)。参见o'brien等,2004,am jepidemiol 159:634-44；whitney等,2003,n engl j med 348:1737-46；kyaw等,2006,nengl j med354:1455-63；hicks等,2007,j infect dis 196:1346-54；traore等,2009,clin infect dis 48:s181-s189。

4、是一种13价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物疫苗，包括血清型1，3，4，5，6a，6b，7f，9v，14，18c，19a，19f和23f。参见例如，美国专利申请公开号us2006/0228380 a1、prymula等,2006,lancet 367:740-48和kieninger等,safety and immunologic non-inferiority of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine compared to 7-valentpneumococcal conjugate vaccine given as a 4-dose series in healthy infantsand toddlers,presented at the 48th annual icaac/isda 46th annual meeting,washington dc,october 25-28,2008。还参见dagan等,1998,infect immun.66:2093-2098和fattom,1999,vaccine 17:126。

5、根据荚膜多糖的结构，肺炎链球菌已分类为90多种血清型。geno,2015,clinicalmicrobiology reviews 28:871–899中提供了已知的肺炎球菌荚膜多糖结构的列表。在意大利专利号it 1418572 b1中描述了血清型23a，但是没有提供结构。

6、当前的多价肺炎球菌缀合物疫苗已经有效地减少了与疫苗中存在的那些血清型有关的肺炎球菌疾病的发病率，例如23f。然而，表达疫苗中不存在的血清型的肺炎球菌的流行率正在增加。此外，包含23f的肺炎球菌缀合物疫苗不提供对血清型23a和23b的交叉保护。因此，需要鉴定并表征新兴的肺炎球菌血清型以包含在未来的疫苗中。

技术实现思路

1、本发明提供了来自肺炎链球菌血清型23a和23b的纯化的荚膜多糖，和具有这些血清型的多糖蛋白缀合物。本发明部分基于来自这些血清型的荚膜多糖的结构鉴定。

2、因此，在一个实施方式中，本发明提供了具有以下重复单元之一的多糖：

3、23a：

4、

5、或

6、23b：

7、

8、来自肺炎链球菌血清型23a的多糖可以表示为

9、

10、其中n表示重复单元的数量。

11、来自肺炎链球菌血清型23b的多糖可以表示为

12、

13、其中n表示重复单元的数量。

14、在某些实施方式中，多糖具有10至5,000个重复单元。在某些方面，多糖具有50至3,000，100至2,500，或100至2,000个重复单元。

15、在某些实施方式中，多糖的分子量为50kda至4,000kda。在某些方面，多糖的分子量为80kda至2,000kda，或100kda至1,500kda。

16、本发明还提供了由以上任何实施方式产生的活化多糖，其中所述多糖用化学试剂活化以产生用于缀合至接头或载体蛋白的反应性基团。在某些实施方式中，肺炎链球菌血清型多糖23a的活化发生在α-rhap或β-glcp上。在某些实施方式中，肺炎链球菌血清型多糖23b的活化发生在β-glcp或β-rhap上。在该实施方式的一个方面，肺炎链球菌血清型多糖23b的活化以大于90％、95％或99％发生在β-rhap上。在某些实施方式中，多糖用高碘酸盐活化。在该实施方式的某些方面，血清型23a多糖的活化发生在α-rhap或β-glcp的第2或第3个碳位上，或血清型23b多糖的活化发生在第β-glcp或β-rhap的第2或第3碳位上。在该方面的一个子方面，血清型23b多糖的高碘酸盐活化以大于90％、95％或99％发生在β-rhap上。

17、本发明还提供了多糖-蛋白缀合物，其中如上所述的多糖或活化多糖缀合至载体蛋白。在某些方面，载体蛋白选自crm197，白喉毒素片段b(dtfb)，dtfb c8，白喉类毒素(dt)，破伤风类毒素(tt)，tt片段c，百日咳类毒素，霍乱类毒素，大肠杆菌lt，大肠杆菌st和铜绿假单胞菌的外毒素a。在一个特定方面，载体蛋白是crm197。

18、在某些方面，在水性条件下或在非质子溶剂例如二甲基亚砜(dmso)中，使用还原胺化化学方法制备多糖-蛋白缀合物。在一个特定的方面，在dmso中使用还原胺化化学方法来制备多糖-蛋白缀合物。

19、在一个实施方式中，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其包含来自肺炎链球菌血清型23a和23b中一种或多种的未缀合的多糖或多糖-蛋白缀合物和来自一种或多种以下肺炎链球菌血清型的未缀合的多糖或多糖-蛋白缀合物：1，2，3，4，5，6a，6b，6c，6d，7b，7c，7f，8，9n，9v，10a，11a，12f，14，15a，15b，15c，16f，17f，18b，18c，19a，19f，20，21，22a，22f，23f，24b，24f，27，28a，31，33f，34，35a，35b，35f和38。在一个子实施方式中，多价免疫原性组合物包含未缀合的多糖或多糖-载体蛋白缀合物，但不包含两者。在一个子实施方式中，多价免疫原性组合物包含未缀合的多糖或多糖-载体蛋白缀合物的混合物。在某些实施方式中，本发明的多价免疫原性组合物具有至多4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90种血清型。