一种联合检测HPV16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合及应用的制作方法

本发明属于检测试剂领域，具体涉及一种联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合及应用。

背景技术：

1、人乳头瘤病毒(human papillomavirus,hpv)hpv引起的宫颈癌的不仅严重威胁着女性健康，而且有着相当重的疾病负担，目前hpv防控形势已经非常严峻，而快速有效的治疗需要及时准确的诊断，hpv16是主要感染型别。目前临床上使用的分子学诊断技术主要是针对hpv dna，检测出hpv dna说明有hpv病毒感染，无法判断hpv dna是否在人体内转录和翻译，确诊hpv感染者中有10％-20％的人hpv dna不会继续转录和翻译病毒蛋白，无转录活性的病毒是过客病毒，其致癌风险极低，然而，一般情况下，一旦发现hpv病毒感染，就会开始采取一些医疗手段，进行一些列检测和治疗，这样耗时长、且容易造成不必要的医疗浪费。

2、因此，亟需一种可同时测dna和rna，耗时短、且能加速hpv诊断中病原学确认、准确性高，避免了医疗浪费的方法。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提供一种联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合和应用，旨在提供建立了一套联合检测hpv16核酸dna和e6转录本mrna方法，实现同时检测hpv核酸dna和致癌基因e6转录本mrna。

2、因此，本发明提供一种联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合，所述联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合包括第一组合和第二组合，其中：

3、所述第一组合包括针对hpv16 dna的两条特异性引物和探针的核苷酸序列如下所示：

4、16qlcr上游引物，所述16qlcr上游引物的核苷酸序列如seq id no：1所示；

5、16qlcr下游引物，所述16qlcr下游引物的核苷酸序列如seq id no：2所示；

6、lcr-pb1探针，所述lcr-pb1探针的核苷酸序列如seq id no：3所示；

7、所述第二组合包括针对hpv16 rna的两条特异性引物和探针的核苷酸序列如下所示：

8、hpv16qe6*上游引物，所述hpv16qe6*上游引物的核苷酸序列如seq id no：4所示；

9、hpv16qe6*下游引物，所述hpv16qe6*下游引物的核苷酸序列如seq id no：5所示；

10、hpv16qe6*的探针，所述hpv16qe6*的探针的核苷酸序列如seq id no：6所示。

11、可选地，所述联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合还包括第三组合：

12、所述第三组合包括针对人类rna的看家基因的两条特异性引物和探针的核苷酸序列如下所示：

13、qtbp上游引物，所述qtbp上游引物的核苷酸序列如seq id no：7所示；

14、qtbp下游引物，所述qtbp下游引物的核苷酸序列如seq id no：8所示；

15、tbp探针，所述tbp探针的核苷酸序列如seq id no：9所示。

16、可选地，所述lcr-pb1探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有非荧光淬灭基团；和/或，

17、所述hpv16qe6*探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。

18、此外，本发明还提供一种联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的试剂盒，包括引物探针组合，所述引物探针组合包括如上所述的联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合。

19、可选地，所述联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的试剂盒还包括pcr反应缓冲液和dna聚合酶。

20、此外，本发明还提供一种联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

21、s10、提取待检样品的dna和rna得待检样品核酸和如上所述的联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的试剂盒；

22、s20、将第一组合、第二组合和第三组合分别与所述待检样品核酸混合、进行实时荧光pcr扩增，分别得第一组合的检测结果、第二组合的检测结果和第三组合的检测结果。

23、s30、将所述第一组合的检测结果、所述第二组合的检测结果和所述第三组合的检测结果分别与预设的ct值比较，根据比较结果来判断hpv16感染情况。

24、可选地，步骤s20中，所述实时荧光pcr扩增程序包括：50℃逆转录15min；95℃预变性2min；95℃变性5s，执行40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸15s收集荧光信号，以获得检测结果。

25、可选地，步骤s30包括：

26、s310、若检测结果显示第三组合的检测结果小于预设ct值，则判定实时荧光pcr扩增反应有效，否则反应无效；

27、s311、在实时荧光pcr扩增反应有效的前提下，若第一组合的检测结果、第二组合的检测结果ct值大于预设ct值，则没有hpv感染；

28、s312、在实时荧光pcr扩增反应有效的前提下，若第一组合的检测结果小于ct值预设值，第二组合的检测结果ct值大于预设ct值，则hpv有感染但无转录活性；

29、s313、在实时荧光pcr扩增反应有效的前提下，若第一组合的检测结果小于ct值预设值，第二组合的rna检测结果ct值小于预设ct值，则hpv有感染且有转录活性。

30、本发明中，通过基于hpv16的高度保守序列筛选出的引物与探针组合，和可能存在同源性序列、具有很好的特异性；同时，结合多重荧光pcr检测技术，与常规生测检测方法相比，不仅仅可以检测出hpv dna的感染，还能检测出dna的转录和翻译，实现了联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性，这样就可以筛选出hpv感染，并确定其是否具有致癌性、这样也避免了医疗资源的浪费。

技术特征：

1.一种联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合，其特征在于，所述联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合包括第一组合和第二组合，其中：

2.如权利要求1所述的联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合，其特征在于，所述联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合还包括第三组合：

3.如权利要求1所述的联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合，其特征在于，所述lcr-pb1探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有非荧光淬灭基团；和/或，

4.一种联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的试剂盒，其特征在于，包括引物探针组合，所述引物探针组合包括如权利要求2所述的联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合。

5.如权利要求4所述的联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的试剂盒，其特征在于，所述联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的试剂盒还包括pcr反应缓冲液和dna聚合酶。

6.一种联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合的检测方法，其特征在于，步骤s20中，所述实时荧光pcr扩增程序包括：50℃逆转录15min；95℃预变性2min；95℃变性5s，执行40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸15s收集荧光信号，以获得检测结果。

8.如权利要求6所述的联合检测hpv16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合的检测方法，其特征在于，步骤s30包括：

技术总结
本发明提供一种联合检测HPV16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合及应用，所述联合检测HPV16病毒感染和病毒转录活性的引物和探针组合包括根据针对HPV16DNA筛选出的高度保守序列设计的16QLCR上游引物，16QLCR下游引物，及LCR‑Pb1探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示以及针对HPV16RNA的HPV16QE6*上游引物、HPV16QE6*下游引物和探针，本发明中，通过基于HPV16的DNA和RNA的特异性保守区域设计出的引物与探针组合，具有很好的特异性，建立了一套联合检测HPV16核酸DNA和E6转录本mRNA方法，实现同时检测HPV核酸DNA和致癌基因E6转录本mRNA。

技术研发人员：魏兰兰
受保护的技术使用者：深圳市第三人民医院（深圳市肝病研究所）
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24